1. iPSC Довідкова інформація для невченого

Стовбурові клітини - це «незрілі» клітини, які ще не зобов’язані стати якимось одним типом клітин. Вони податливі, оскільки мають потенціал перерости в безліч різних типів зрілих клітин в організмі, таких як клітини, що складають серце або судини, та інші тканини та органи. У 2007 році дослідники виявили стратегію створення стовбурових клітин у лабораторії шляхом перепрограмування зрілих дорослих клітин, які ми зазвичай вирощуємо для дослідницьких цілей.^{1, 2} . Ці штучно створені стовбурові клітини називаються індукованими плюрипотентними стовбуровими клітинами (“iPSC”). Для поля Прогерія це величезний прорив. Вперше вчені тепер можуть створювати стовбурові клітини Прогерії та задавати питання про те, як функціонують та розвиваються стовбурові клітини в Прогерії. Раніше не було джерела людських стовбурових клітин Progeria, і тому була порожня інформація про те, як функціонують стовбурові клітини Progeria порівняно зі стовбуровими клітинами людей без Progeria. Крім того, вчені можуть перепрограмувати стовбурові клітини Progeria, щоб вперше створити зрілі кровоносні судини Progeria, клітини серця та інші типи клітин. До цього часу не було джерела людських прогерійних серцевих або клітин кровоносних судин.  Тепер ми можемо попросити ключ питання про серцеву хворобу, яка призводить до ранньої смерті в Прогерії від інфарктів та інсультів. Ми можемо порівняти ці відкриття із серцевими захворюваннями та старінням у загальній популяції та дізнатися більше про те, що впливає на старіння у всіх нас. Вже було опубліковано кілька чудових досліджень із використанням стовбурових клітин Progeria.^3-5  Наша мета в The Progeria Research Foundation - сприяти багатьом іншим відкриттям, використовуючи цей безцінний інструмент. Праймер щодо стовбурових клітин див. На веб-сайті уряду США: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

2. Призначення генерування та розподілу індукованих плюрипотентних стовбурових клітин (iPSC) Науковим фондом Прогерії

Місія Науково-дослідного фонду Progeria полягає у відкритті способів лікування та лікування ліків від синдрому Хатчінсона-Гілфорда Прогерії та його старечих порушень. У 2009 PRF вступив у співпрацю з експертною групою вчених університету Торонто, Канада, під керівництвом доктора Вільяма Стенфорда, щоб створити високоякісні iPSC Progeria. Доктор Стенфорд є науково-дослідницьким відділом Канади з інтегративної біології стовбурових клітин. Станом на 2011, PRF продовжує співпрацювати з доктором Стенфордом в Університеті Оттави, Канада, де він є професором стільникової та молекулярної медицини медичного факультету та старшим науковим співробітником Центру досліджень штамтових клітин Інституту лікарні Оттави.

Наша мета - надати цей безцінний інструмент дослідникам у всьому світі. Цей новий інструмент дослідження буде використаний для створення нових та інноваційних досліджень у Прогерії, а також щодо її зв’язку із захворюваннями серця та старінням.  

3. Покоління прогерійного синдрому Хатчінсона-Гілфорда-Прогерії та плюріпотентних стовбурових клітин (iPSC)

Індуковані плюрипотентні стовбурові клітини (iPSC) були отримані за допомогою ретровірусної трансдукції VSVG з чотирьох людських факторів Oct4, Sox2, Klf4 та c-Myc у фібробласти. Колонії iPSC отримували на миша-ембріональних фібробластах (MEF). Застосовувана процедура була, по суті, описаною раніше, але без використання репортера EOS (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009). 

4. Контроль якості: перевірка та характеристика

Наразі доступні рядки пройшли кілька етапів перевірки (див. Завантажувані PDF-файли нижче):

5. Оригінальний вихідний матеріал, з якого були отримані ці клітини iPS

iPSC отримували з нетрансформованих клітинних ліній клітин PRF Cell & Tissue Bank.

Метод трансдукції, використовуваний для всіх ліній iPS, був ретровірусним MKOS.

Ідентифікатор лінії iPSC	Мутація	Стать та донорський вік	Тип клітини, що походить Натисніть тут.	Підтримка даних
HGADFN003 iPS 1B	LMNAExon 11, 1824 C> T	Чоловік 2yr 0mo	Дермальні фібробласти HGADFN003	003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Чоловік 2yr 0mo	Дермальні фібробласти HGADFN003	003 iPS1C
HGDFN003 iPS 1D	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Чоловік 2yr 0mo	Дермальні фібробласти HGADFN003	003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Чоловік 8yr 5mo	Дермальні фібробласти HGADFN167	167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Чоловік 8yr 5mo	Дермальні фібробласти HGADFN167	167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B	Мати HGADFN167 (не впливає)	Жіночий 37yr 10mo	Дермальні фібробласти HGMDFN090	090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C	Мати HGADFN167 (не впливає)	Жіночий 37yr 10mo	Дермальні фібробласти HGMDFN090	090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2	Батько HGADFN167 (не впливає)	Чоловік 40yr 5mo	Шкірні фібробласти HGFDFN168	168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1P	Батько HGADFN167 (не впливає)	Чоловік 40yr 5mo	Дермальні фібробласти HGFDFN168	168 iPS1P

6. Приєднуйтесь до нашого списку електронних листів для майбутніх оновлень iPSC та нових ліній стільникового зв'язку

Ми продовжуємо генерувати лінії iPSC. Якщо ви хочете періодично отримувати новини про iPSC, що зберігаються в PRF Cell & Tissue Bank, будь ласка, приєднайтеся до нашого списку розсилки, натиснувши тут

7. Питання?

З будь-якими питаннями та потребами звертайтесь до Леслі Гордон, доктора наук, медичного директора, за адресою lgordon@progeriaresearch.org або 978-535-2594

8. Впорядкування клітинних ліній iPS

У 2014, PRF запровадив політику без змін до нашої МТА. Це результат договірних договорів 12 з дослідницькими групами 70, що працюють в установах країн 14. PRF та його захисник взяли до уваги питання, що виникли в той період часу, і відповідно відредагували угоду, в результаті чого ми вважаємо справедливими та розумні умови.

З питань федеральних урядових установ США або питань, будь ласка, зв'яжіться з Венді Норріс за адресою: wnorris@lifespan.org or 401-274-1122 x 48063.

Крок 1: Заповніть заявку та договір про передачу матеріалів

Заява та угода для неурядових установ

Угода про передачу матеріалів для неурядових установ

Крок 2: Поверніть заповнену заявку та угоду про передачу матеріалів Венді Норріс на адресу wnorris@lifespan.org. Після затвердження ви отримаєте електронний лист із підтвердженням замовлення та передбачуваною датою доставки. 

Крок 3: В даний час лабораторія доктора Стенфорда розповсюджує лінії в заморожених кріофайлах. Його лабораторія надішле вам електронною поштою інформацію про доставку та відстеження, коли культуру буде відправлено. Досвідчених дослідників направляють на навчання на спеціалізованих курсах, необхідних для роботи людських ембріональних стовбурових клітин / iPSC.

Центр плюрипотентних стовбурових клітин людини (під керівництвом доктора Стенфорда) в Дослідницькому інституті лікарні Оттави пропонує віртуальне індивідуальне навчання основам методів культивування iPSC, характерних для клітинних ліній Progeria iPSC. Варіанти та формат навчання є гнучкими залежно від рівня досвіду науковців.  Для отримання додаткової інформації, будь ласка, надішліть електронну пошту на hpscf@ohri.ca.

Крок 4: Університет Оттави виставлятиме вам рахунки безпосередньо за кожну лінію iPSC плюс кур'єрські витрати, якщо такі є.

9. Підготовка HGPS та контролю iPS для клітинних культур

iPSC та ESC потрібно подавати за допомогою mTeSR Plus від Stem Cell Technologies (кат. № 5825). Дотримуйтесь рекомендацій постачальника щодо зберігання.

10. Підготовка пластин «Матригель»

примітки: Усі кроки, що стосуються матригелю, слід робити якомога швидше і залишатися якомога холоднішим.

1. Розморозьте пляшку матригелю при 4°C. Перевірте сертифікат аналізу цієї партії, щоб визначити концентрацію білка.
2. Додайте достатньо холодного середовища DMEM/F12 до розмороженого матригелю, щоб досягти кінцевої концентрації 5 мг/мл.
3. Зробіть аліквоти по 1 мл підготовленого матригелю зі стадії 2 у попередньо охолоджені пробірки Falcon об’ємом 15 мл.
4. Заморозьте та зберігайте всі аліквоти при -20°C.
5. Щоб зробити пластини з матригелем, видаліть одну аліквоту матригелю (1 мл) з -20°C і додайте 10 мл холодного DMEM/F12. Добре перемішайте, поки гранули не розморозяться (без утворення бульбашок і завжди тримайте розчин холодним).
6. Перенесіть у пробірку на 50 мл, потім додайте 20 мл холодного DMEM/F12 (1 мл аліквоти матригелю розводять у 30 мл DMEM/F12), добре перемішайте.
7. Планшет (1 мл/лунка для 6-лункового планшета, 0.5 мл/лунка для 12-лункового планшета, 0.25 мл/лунка для 24-лункового планшета). Переконайтеся, що розчин покриває всю площу поверхні, обережно струснувши пластину. Не заморожуйте повторно залишки матригелю.
8. Якщо ви використовуєте тарілку негайно, дайте їй постояти при кімнатній температурі протягом 1 години (або 30 хвилин при 37°В), спостерігайте матригель під мікроскопом. Матригель повинен добре розсіюватися і не «збиватися».
9. Якщо використовувати пластини в інший час, оберніть край пластини парафільмом і зберігайте при 4°C до 2 тижнів.

Matrigel - BD / Fisher, кішка # CB-40230

DMEM / F12 - Life Technologies, кішка № 11330-057

Доктор Вільям Стенфорд-2022

11. Розморожування клітин ES або iPS (на кріо-флакон)

1. Вийміть пластину матригелю з температури 4°C і нагрійте її при кімнатній температурі протягом однієї години або зробіть нову пластину матригелю (див. протокол підготовки пластини матригелю).
2. Нагрійте 4 мл mTeSR Plus у пробірці Falcon на 15 мл.
3. Вийміть клітини з резервуара з рідким азотом і покрутіть у бані при 37 °C, доки не залишиться невеликий шматочок льоду. Флакон повинен розморозитися за 1-2 хвилини. Цей крок потрібно зробити швидко.
4. Стільникову трубку з етанолом і пробку з соколами і помістіть у витяжку.
5. Використовуйте 1 мл широкий кінчик рота повільно додайте клітини до 4 мл попередньо підігрітого середовища (уникайте змішування клітинної суспензії).
6. Віджимайте при 130 rcf протягом 5 хвилин.
7. Видалити супернатант.
8. Додайте 2 мл середовища PSC широкою горловиною обережно розбийте грудки. Перенесіть середовище в одну лунку 6-лункового планшета, додайте 2 мкл інгібітора ROCK (Y27632, кінцева концентрація 10 мкМ). Планшет в одну покриту матригелем лунку (6-лунковий планшет).
9. Обережно покачайте клітини, щоб рівномірно розподілити їх, і помістіть в гіпоксичний інкубатор (5% O₂, 10% CO₂). Уникайте порушення пластини протягом 24 годин після посіву.

   ПРИМІТКА: Дуже важливо уникати надмірного руйнування грудок або агресивного піпетування. Це може значно знизити виживаність. На момент посіву клітини повинні залишатися у вигляді шматків по 100-300 клітин. Будьте обережні, але намагайтеся працювати швидко, коли клітини розморожені, щоб мінімізувати час їхнього контакту з кріопротектором.​

10. Видаліть середовище через 24 години та додайте 2 мл середовища PSC (для 6-лункового планшета, 1 мл для 12-лункового та 0.5 мл для 24-лункового планшета). Див. Збір і догляд за протоколом hESC/iPSC.

ЗМІ PSC

mTeSR Plus від Stem Cell Technologies (кат. № 5825). Дотримуйтесь рекомендацій постачальника щодо зберігання.

Що таке інгібітор ROCK Y27632?

Інгібітор ROCK Y27632 є селективним інгібітором Rho-асоційованої кінази p160 ROCK. Обробка інгібітором ROCK Y27632 запобігає індукованому дисоціацією апоптозу ембріональних стовбурових клітин людини (hESC) і індукованих плюрипотентних стовбурових клітин людини (iPSC), збільшуючи рівень виживання та підтримуючи плюрипотентність під час субкультивування та розморожування hESC і hiPSC. Показано також, що інгібітор ROCK Y27632 підвищує рівень виживання стовбурових клітин під час кріоконсервації. Зауважте, що аліквоти інгібіторів породи чутливі до світла та повторюваних циклів заморожування та відтавання. Обов’язково використовуйте ці аліквоти протягом терміну придатності, рекомендованого постачальником.

Доктор Вільям Стенфорд-2022

12. Збирання та догляд за hESC/iPSC

1. Наступного дня після розморожування клітин подивіться на них під мікроскопом, щоб визначити рівень виживання. ПРИМІТКА: спостерігати велику кількість неприкріплених клітин – це нормально. Поки деякі клітини прикріплені, колонії можуть виникати з них протягом 3-7 днів.
2. Вийміть середовище з лунок і прокапайте 2 мл (для 6-лункового, 1 мл для 12-лункового та 0.5 мл для 24-лункового планшета) свіжого та теплого середовища PSC на лунку. Поверніть планшет в інкубатор.
3. Клітини живляться до злиття 60-70% (дотримуйтесь рекомендацій постачальника).
4. На другий день слід спостерігати за клітинами та очищати їх від диференційованих клітин, які можуть зростати.
5. Щоб очистити клітини, використовуйте ковпак для збирання та зіскрібайте диференційовані клітини наконечником піпетки.
6. Після очищення клітин змініть середовище, як це було зроблено в описаних вище кроках.

(Див. Заморожування hESC/iPSC або Проходження hESC/iPSC)

ПРИМІТКА:

Було визначено, що середовище PSC є більш ефективним у гіпоксичному середовищі. Ми також спостерігали, що менша диференціація відбувається, коли клітини вирощуються в гіпоксичних інкубаторах порівняно з нормоксичними. Нарешті, посіяні клітини мають кращий рівень виживання при використанні гіпоксичного інкубатора.

Нормоксик: 37°C, 21% O₂, 5% CO₂

Гіпоксичний: 37°С, 5% О₂, 10% CO₂

Доктор Вільям Стенфорд-2022

13. Проходження hESC/iPSC

1. Додайте 2 мл середовища PSC у 6-лунковий планшет, покритий матригелем, і відставте.
2. Візьміть планшет для пасування, видаліть середовище з лунки та промийте один раз 1 мл PBS (-/-).
3. Додайте в лунку 1 мл розчину EDTA і залиште на 3-4 хвилини при кімнатній температурі. Не рухайте пластину, оскільки клітини можуть почати від’єднуватися.
4. Видаліть розчин ЕДТА та додайте 1 мл середовища PSC. Не залишайте EDTA на клітинах більше ніж на 4 хвилини, оскільки це призведе до відриву клітин.
5. Зішкрібте клітини за допомогою скребка для клітин і розподіліть клітини між 6 лунками планшета, що містить середовище PSC. Уникайте надмірного роздроблення частинок колонії та намагайтеся обережно зішкрібати. Намагайтеся зберігати клітини великими шматками. Використовуйте наконечник піпетки з широким отвором, щоб розбити грудки, якщо необхідно. Надмірне розщеплення клітин може спричинити загибель клітин або надмірну спонтанну диференціацію після пасажу.
6. Висиджувати при 37°C після рівномірного розподілу клітин у кожній лунці (8 цифр або L-подібне струшування). Уникайте порушення пластини протягом 24 годин після пасажу.

ПРИМІТКА: Після того, як клітини зіскоблено, потрібно якнайшвидше перенести їх на нову пластину, оскільки клітини швидко приєднаються знову (протягом 5 хвилин).

Якщо EDTA залишити на клітинах більше 4 хвилин, клітини можуть почати відшаровуватися. Якщо це станеться, просто зберіть клітини в 15 мл Falcon з 4 мл середовища PSC. Обертайте клітини при 130 rcf протягом 5 хвилин. Ресуспендуйте осад з 1 мл середовища та рівномірно розподіліть між 6-лунковим планшетом, покритим матригелем (160 мкл на лунку).

Розчин ЕДТА: додайте 500 мкл 0.5 М ЕДТА (pH 8.0) у 500 мл DPBS (-/-). Додайте 0.9 г NaCl. Відфільтруйте розчин для стерилізації та зберігайте його при 4°C до 6 місяців.

З паперу:

Пасирування та розширення колоній людських плюрипотентних стовбурових клітин шляхом ензимної дисоціації в хімічно визначених умовах культури

Жарені пива,¹ Даніель Р. Гулбрансон,^2,3 Ніколь Джордж,⁴Лорен І. Синіскальчі,¹ Джеффрі Джонс,^4,5 Джеймс А. Томсон,^2,3,6 та Гукай Чень^1,2

14. Заморожування hESC/iPSC

1. Увімкніть Bio-Cool (морозильна камера з контрольованою швидкістю) і встановіть температуру до -7°C.
2. Вийміть клітини з інкубатора та спостерігайте злиття та морфологію під мікроскопом.
3. Якщо лунки конфлюентні на 70%, видаліть старі середовища та промийте один раз PBS (-/-), а потім додайте 1 мл розчину EDTA (див. пропускання з розчином EDTA) у кожну лунку.
4. Інкубуйте при кімнатній температурі протягом 3-4 хв.
5. Аспіруйте розчин ЕДТА та додайте 1 мл холодного середовища mFreSR (кат. № 05855, Stem Cell Technologies).
6. Використовуйте скребок для клітин, щоб обережно підняти клітини. Зберігайте клітини великими шматками, наскільки це можливо, і уникайте піпетування вгору та вниз.
7. Перенесіть клітини/mFreSR у кріопробірку за допомогою широкого горловини. Тримайте флакони на льоду до готовності до кроку 8.
8. Помістіть пробірки в Bio-Cool та інкубуйте протягом 10 хвилин.
9. Отримують рідкий азот.
10. Через 10 хвилин посійте клітини, зануривши шпатель у рідкий азот і торкнувшись краю кріопробирки протягом приблизно 10-30 секунд або поки не побачите кристали на стороні кріопробирки.
11. Запустіть програму 1, натиснувши кнопку «PROG», і пройдіть програму, натиснувши кнопку ще раз, і ви повинні побачити швидкість 0.5°C/хв. , а потім натисніть «RUN».
12. Коли температура досягне -65°C, кріопробірки можна буде переносити та зберігати в рідкому азоті.

Альтернативи

Інший варіант – помістити кріопробірки в контейнер для заморожування (Biocision-CoolCell) і зберігати при -80°C протягом ночі. Перемістіть кріопробірки в рідкий азот (рідка або парова фаза) наступного дня.

Доктор Вільям Стенфорд-2022