1. iPSC Hintergrundinformationen für den Nichtwissenschaftler

Stammzellen sind „unreife“ Zellen, die sich noch nicht dazu verpflichtet haben, ein einziger Zelltyp zu werden. Sie sind biegsam, weil sie das Potenzial haben, sich zu vielen verschiedenen Arten reifer Zellen im Körper zu entwickeln, beispielsweise zu Zellen, aus denen das Herz oder die Blutgefäße bestehen, sowie zu anderen Geweben und Organen. 2007 entdeckten die Forscher eine Strategie zur Erzeugung von Stammzellen im Labor, indem sie reife adulte Zellen neu programmierten, die wir üblicherweise zu Forschungszwecken züchten.^{1, 2} . Diese künstlich erzeugten Stammzellen werden als induzierte pluripotente Stammzellen („iPSCs“) bezeichnet. Für Progerien ist dies ein großer Durchbruch. Zum ersten Mal können Wissenschaftler nun Progeria-Stammzellen herstellen und Fragen dazu stellen, wie Stammzellen in Progeria funktionieren und sich entwickeln. Zuvor gab es keine Quelle für menschliche Progeria-Stammzellen, und daher gab es keine Informationen darüber, wie Progeria-Stammzellen im Vergleich zu Stammzellen von Menschen ohne Progeria funktionieren. Darüber hinaus können Wissenschaftler die Progeria-Stammzellen neu programmieren, um zum ersten Mal reife Progeria-Blutgefäße, Herzzellen und andere Zelltypen zu erzeugen. Bisher gab es keine Quelle für menschliche Progeria-Herz- oder Blutgefäßzellen.  Wir können jetzt Schlüssel fragen Fragen zur Herzkrankheit, die in Progerien zum frühen Tod durch Herzinfarkt und Schlaganfall führt. Wir können diese Entdeckungen mit der Herzkrankheit und dem Altern in der Allgemeinbevölkerung vergleichen und mehr darüber herausfinden, was das Altern in uns allen beeinflusst. Es wurden bereits mehrere hervorragende Studien mit Progeria-Stammzellen veröffentlicht.^3-5  Unser Ziel bei der Progeria Research Foundation ist es, mit diesem unschätzbaren Werkzeug viele weitere Entdeckungen zu ermöglichen. Eine Grundierung für Stammzellen finden Sie auf dieser Website der US-Regierung: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

2. Zweck der Erzeugung und Verteilung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSC) durch die Progeria Research Foundation

Die Mission der Progeria Research Foundation ist es, Behandlungen und Heilmittel für das Hutchinson-Gilford-Progeria-Syndrom und seine altersbedingten Störungen zu entdecken. In 2009 ging PRF eine Zusammenarbeit mit einem Expertenteam von Wissenschaftlern an der Universität von Toronto, Kanada, unter der Leitung von William Stanford, PhD, ein, um hochwertige Progeria iPSCs zu generieren. Dr. Stanford ist der kanadische Forschungslehrstuhl für integrative Stammzellbiologie. Ab 2011 arbeitet PRF weiterhin mit Dr. Stanford an der Universität von Ottawa, Kanada, zusammen, wo er Professor für Zelluläre und Molekulare Medizin, Medizinische Fakultät und Senior Scientist am Sprott Center for Stem Cell Research des Ottawa Hospital Research Institute ist.

Unser Ziel ist es, Forschern auf der ganzen Welt dieses unschätzbare Werkzeug zur Verfügung zu stellen. Dieses neue Forschungsinstrument wird verwendet, um neue und innovative Forschungsergebnisse in Progerien sowie deren Beziehung zu Herzkrankheiten und Alterung zu generieren.  

3. Erzeugung von Hutchinson-Gilford-Progeria-Syndrom-induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs)

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) wurden unter Verwendung der VSVG-pseudotypisierten retroviralen Transduktion von vier menschlichen Faktoren, Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc, in Fibroblasten abgeleitet. iPSC-Kolonien wurden von Maus-Embryonal-Fibroblasten (MEFs) abgeleitet. Das verwendete Verfahren war im Wesentlichen wie zuvor beschrieben, jedoch ohne die Verwendung des EOS-Reporters (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009). 

4. Qualitätskontrolle: Validierung und Charakterisierung

Die derzeit verfügbaren Zeilen wurden mehreren Validierungsschritten unterzogen (siehe PDFs zum Herunterladen unten):

5. Ursprüngliches Ausgangsmaterial, von dem diese iPS-Zellen abgeleitet wurden

iPSCs wurden von nicht transformierten Fibroblasten-Zelllinien der PRF Cell & Tissue Bank abgeleitet.

Die für alle iPS-Linien verwendete Transduktionsmethode war Retrovirus MKOS.

iPSC-Leitungs-ID	Mutation	Geschlecht und Spendenalter	Zelltyp des Ursprungs Hier geht es weiter..	Unterstützende Daten
HGADFN003 iPS 1B	LMNAExon 11, 1824 C> T	Männchen 2yr 0mo	Dermale Fibroblasten HGADFN003	003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Männchen 2yr 0mo	Dermale Fibroblasten HGADFN003	003 iPS1C
HGDFN003 iPS 1D	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Männchen 2yr 0mo	Dermale Fibroblasten HGADFN003	003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Männchen 8yr 5mo	Dermale Fibroblasten HGADFN167	167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Männchen 8yr 5mo	Dermale Fibroblasten HGADFN167	167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B	Mutter von HGADFN167 (nicht betroffen)	Weibchen 37yr 10mo	Dermale Fibroblasten HGMDFN090	090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C	Mutter von HGADFN167 (nicht betroffen)	Weibchen 37yr 10mo	Dermale Fibroblasten HGMDFN090	090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2	Vater von HGADFN167 (nicht betroffen)	Männchen 40yr 5mo	Dermale Fibroblasten HGFDFN168	168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1P	Vater von HGADFN167 (nicht betroffen)	Männchen 40yr 5mo	Dermale Fibroblasten HGFDFN168	168 iPS1P

6. Tragen Sie sich in unsere E-Mail-Liste ein, um zukünftige iPSC-Updates und neue Zelllinien zu erhalten

Wir generieren weiterhin iPSC-Leitungen. Wenn Sie regelmäßig über iPSCs in der PRF Cell & Tissue Bank informiert werden möchten, klicken Sie auf unsere E-Mail-Liste hier

7. Fragen?

Bei Fragen oder Wünschen wenden Sie sich bitte an Leslie Gordon, MD, PhD, Medical Director, unter lgordon@progeriaresearch.org oder 978-535-2594

8. Bestellung von iPS-Zelllinien

In 2014 hat PRF eine Richtlinie eingeführt, die keine Änderungen an unserem MTA vorsieht. Dies ist das Ergebnis jahrelanger vertraglicher Vereinbarungen mit 12-Forschungsteams, die an Einrichtungen in 70-Ländern arbeiten. PRF und sein Anwalt haben die in diesem Zeitraum aufgetretenen Probleme berücksichtigt und die Vereinbarung dementsprechend überarbeitet, was unserer Meinung nach zu fairen und angemessenen Bedingungen geführt hat.

Bei Institutionen oder Fragen der US-Bundesregierung wenden Sie sich bitte an Wendy Norris unter: wnorris@lifespan.org or 401-274-1122 x 48063.

Schritt 1: Schließen Sie einen Antrags- und Materialtransfervertrag ab

Antrag und Vereinbarung für nichtstaatliche Institutionen

Materialtransfervertrag für nichtstaatliche Institutionen

Schritt 2: Senden Sie den ausgefüllten Antrag und die Materialübertragungsvereinbarung an Wendy Norris unter wnorris@lifespan.org. Nach der Genehmigung erhalten Sie eine E-Mail, in der Ihre Bestellung und das voraussichtliche Versanddatum bestätigt werden. 

Schritt 3: Das Labor von Dr. Stanford verteilt derzeit Leitungen in gefrorenen Kryovials. Sein Labor wird Ihnen nach Versand der Kultur eine E-Mail mit Versand- und Nachverfolgungsinformationen senden. Unerfahrene Forscher werden angewiesen, Schulungen in speziellen Kursen zu erhalten, die für die Arbeit mit menschlichen embryonalen Stammzellen / iPSCs unerlässlich sind.

Die Human Pluripotent Stem Cell Facility (unter der Leitung von Dr. Stanford) am Ottawa Hospital Research Institute bietet virtuelle Einzelschulungen zu den Grundlagen der iPSC-Kulturtechniken an, die für die Progeria iPSC-Zelllinien spezifisch sind. Trainingsmöglichkeiten und -format sind je nach Erfahrungsstand der Wissenschaftler flexibel.  Für weitere Informationen senden Sie bitte eine E-Mail an hpscf@ohri.ca.

Schritt 4: Die Universität von Ottawa stellt Ihnen jede iPSC-Leitung direkt in Rechnung, zuzüglich etwaiger Kurierkosten.

9. Herstellung von HGPS- und Kontroll-iPS-Zellkulturmedien

iPSC und ESCs müssen mit mTeSR Plus von Stem Cell Technologies (Kat.-Nr. 5825) gefüttert werden. Bitte befolgen Sie die Empfehlungen des Lieferanten zur Lagerung.

10. Vorbereitung der Matrigel-Platten

Note: Alle Schritte mit Matrigel sollten so schnell wie möglich durchgeführt werden und so kalt wie möglich bleiben.

1. Matrigelflasche bei 4 auftauen°C. Überprüfen Sie das Analysezertifikat für diese Charge, um die Proteinkonzentration zu finden.
2. Fügen Sie dem aufgetauten Matrigel genügend kaltes DMEM/F12-Medium hinzu, um eine Endkonzentration von 5 mg/ml zu erreichen.
3. Machen Sie 1-ml-Aliquots des vorbereiteten Matrigels aus Schritt 2 in vorgekühlten 15-ml-Falcon-Röhrchen.
4. Einfrieren und alle Aliquots bei -20 lagern°C.
5. Um Matrigelplatten herzustellen, entfernen Sie ein Aliquot Matrigel (1 ml) von -20°C und fügen Sie 10 ml kaltes DMEM/F12 hinzu. Gut mischen, bis das Pellet auftaut (ohne Blasen zu bilden, und die Lösung immer kalt halten).
6. In ein 50-ml-Röhrchen überführen, dann 20 ml kaltes DMEM/F12 hinzufügen (1 ml Matrigel-Aliquot wird in 30 ml DMEM/F12 verdünnt), gut mischen.
7. Platte (1 ml/Well für 6-Well-Platte, 0.5 ml/Well für 12-Well-Platte, 0.25 ml/Well für 24-Well-Platte). Stellen Sie sicher, dass die Lösung die gesamte Oberfläche bedeckt, indem Sie die Platte vorsichtig schütteln. Frieren Sie übrig gebliebenes Matrigel nicht wieder ein.
8. Wenn Sie die Platte sofort verwenden, lassen Sie die Platte 1 Stunde (oder 30 Minuten bei 37°C), Matrigel unter dem Mikroskop beobachten. Matrigel sollte gut dispergiert und nicht „klumpig“ sein.
9. Wenn Sie die Platten zu einem anderen Zeitpunkt verwenden, wickeln Sie den Rand der Platte mit Parafilm ein und lagern Sie sie bei 4°C für bis zu 2 Wochen.

Matrigel - BD / Fisher, Katze # CB-40230

DMEM / F12 - Life Technologies, Kat.-Nr. 11330-057

Dr. William Stanford-2022

11 Auftauen von ES- oder iPS-Zellen (pro Kryo-Fläschchen)

1. Nehmen Sie eine Matrigelplatte aus 4°C und erwärmen Sie sie eine Stunde lang auf Raumtemperatur oder stellen Sie eine neue Matrigelplatte her (siehe Protokoll zur Vorbereitung der Matrigelplatte).
2. Erwärmen Sie 4 ml mTeSR Plus in einem 15-ml-Falcon-Röhrchen.
3. Entfernen Sie die Zellen aus dem Flüssigstickstofftank und schwenken Sie sie in einem 37 °C warmen Bad, bis nur noch ein kleiner Eisklumpen übrig ist. Die Durchstechflasche sollte in 1-2 Minuten auftauen. Dieser Schritt muss schnell erfolgen.
4. Ethanol-Zellröhrchen und Falcon-Medienröhrchen in die Haube stellen.
5. Verwenden Sie 1 ml breite Mundspitze zu langsam fügen Sie Zellen zu 4 ml vorgewärmtem Medium hinzu (vermeiden Sie das Mischen der Zellsuspension).
6. 130 Minuten bei 5 RZB schleudern.
7. Überstand entfernen.
8. Fügen Sie 2 ml PSC-Medium hinzu und verwenden Sie eine Weithalsspitze Klumpen sanft auflösen. Übertragen Sie das Medium in eine Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen und fügen Sie 2 &mgr;l ROCK-Inhibitor (Y27632, Endkonzentration von 10 &mgr;M) hinzu. In eine mit Matrigel beschichtete Vertiefung (einer Platte mit 6 Vertiefungen) ausplattieren.
9. Schütteln Sie die Zellen vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, und legen Sie sie in einen hypoxischen Inkubator (5 % O₂, 10% CO₂). Vermeiden Sie Plattenstörungen für 24 Stunden nach der Aussaat.

   Anmerkungen: Es ist sehr wichtig, übermäßiges Aufbrechen von Klumpen oder aggressives Pipettieren zu vermeiden. Dies kann die Überlebensrate erheblich reduzieren. Die Zellen sollten zum Zeitpunkt der Aussaat in Brocken von 100-300 Zellen bleiben. Seien Sie vorsichtig und versuchen Sie schnell zu arbeiten, sobald die Zellen aufgetaut sind, um die Zeit zu minimieren, in der sie mit Kryoschutzmittel in Kontakt kommen

10. Entfernen Sie die Medien nach 24 Stunden und fügen Sie 2 ml PSC-Medium hinzu (für eine 6-Well-Platte, 1 ml für eine 12-Well-Platte und 0.5 ml für eine 24-Well-Platte). Siehe Ernte und Pflege des hESC/iPSC-Protokolls.

PSC-Medien

mTeSR Plus von Stem Cell Technologies (Kat.-Nr. 5825). Bitte befolgen Sie die Empfehlungen des Lieferanten zur Lagerung.

Was ist ROCK Inhibitor Y27632?

ROCK Inhibitor Y27632 ist ein selektiver Inhibitor der Rho-assoziierten Kinase p160 ROCK. Die Behandlung mit dem ROCK-Inhibitor Y27632 verhindert die dissoziationsinduzierte Apoptose humaner embryonaler Stammzellen (hESC) und humaninduzierter pluripotenter Stammzellen (iPSC), erhöht die Überlebensrate und erhält die Pluripotenz während der Subkultivierung und des Auftauens von hESCs und hiPSCs. ROCK Inhibitor Y27632 erhöht nachweislich auch die Überlebensrate von Stammzellen während der Kryokonservierung. Beachten Sie, dass Gesteinsinhibitor-Aliquots empfindlich auf Licht und wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen reagieren. Stellen Sie sicher, dass Sie diese Aliquots innerhalb der vom Lieferanten empfohlenen Haltbarkeit verwenden.

Dr. William Stanford-2022

12 Ernte und Pflege von hESC/iPSC

1. Betrachten Sie die Zellen am Tag nach dem Auftauen unter dem Mikroskop, um die Überlebensrate zu bestimmen. HINWEIS: Es ist normal, eine hohe Anzahl von ungebundenen Zellen zu beobachten. Solange einige Zellen anhaften, können daraus innerhalb von 3 – 7 Tagen Kolonien entstehen.
2. Entfernen Sie das Medium aus den Wells und pipettieren Sie 2 ml (für eine 6-Well-, 1 ml für eine 12-Well- und 0.5 ml für eine 24-Well-Platte) frisches und warmes PSC-Medium pro Well. Platte zurück in den Inkubator geben.
3. Die Zellen werden bis zu einer Konfluenz von 60-70% gefüttert (befolgen Sie die Empfehlungen des Lieferanten).
4. Ab Tag 2 sollten die Zellen beobachtet und von eventuell wachsenden differenzierten Zellen gereinigt werden.
5. Verwenden Sie zum Reinigen der Zellen die Picking-Haube und kratzen Sie differenzierte Zellen mit einer Pipettenspitze ab.
6. Sobald die Zellen gereinigt sind, wechseln Sie die Medien wie in den obigen Schritten.

(Siehe Einfrieren von hESC/iPSC oder Bestehen von hESC/iPSC)

Anmerkungen:

Es wurde festgestellt, dass PSC-Medien in einer hypoxischen Umgebung effizienter sind. Wir haben auch beobachtet, dass weniger Differenzierung auftritt, wenn Zellen in hypoxischen Inkubatoren im Vergleich zu normoxischen gezüchtet werden. Schließlich haben ausgesäte Zellen eine bessere Überlebensrate, wenn sie einen hypoxischen Inkubator verwenden.

Normoxisch: 37°C, 21 % O₂, 5% CO₂

Hypoxisch: 37°C, 5 % O₂, 10% CO₂

Dr. William Stanford-2022

13 hESC/iPSC bestanden

1. Fügen Sie 2 ml PSC-Medium zu einer mit Matrigel beschichteten Platte mit 6 Vertiefungen hinzu und legen Sie sie beiseite.
2. Nehmen Sie die zu passierende Platte und entfernen Sie die Medien aus dem Brunnen und waschen Sie sie einmal mit 1 ml PBS (-/-).
3. 1 ml der EDTA-Lösung in die Vertiefung geben und 3-4 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Bewegen Sie die Platte nicht herum, da sich Zellen lösen können.
4. Entfernen Sie die EDTA-Lösung und fügen Sie 1 ml PSC-Medium hinzu. Lassen Sie EDTA nicht länger als 4 Minuten auf den Zellen, da dies zum Abheben der Zellen führt.
5. Schaben Sie die Zellen mit einem Zellschaber ab und teilen Sie die Zellen auf die 6 Vertiefungen Ihrer Platte mit PSC-Medien auf. Vermeiden Sie ein übermäßiges Aufbrechen der Koloniestücke und versuchen Sie, beim Schaben vorsichtig vorzugehen. Versuchen Sie, die Zellen in großen Stücken zu halten. Verwenden Sie bei Bedarf eine Pipettenspitze mit weiter Öffnung, um Klumpen aufzubrechen. Übermäßiges Aufbrechen von Zellen kann Zelltod oder übermäßige spontane Differenzierung nach der Passage verursachen.
6. Inkubieren bei 37°C nach gleichmäßiger Verteilung der Zellen in jeder Vertiefung (8-stelliges oder L-förmiges Schütteln). Vermeiden Sie Plattenstörungen für 24 Stunden nach der Passage.

HINWEIS: Sobald die Zellen abgeschabt wurden, möchten Sie sie so schnell wie möglich auf die neue Platte übertragen, da sich die Zellen schnell wieder anheften (innerhalb von 5 Minuten).

Wenn EDTA länger als 4 Minuten auf den Zellen verbleibt, können sich die Zellen ablösen. Sammeln Sie in diesem Fall die Zellen einfach in einem 15-ml-Falken mit 4 ml PSC-Medium. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 130 RZB für 5 Minuten. Resuspendieren Sie das Pellet mit 1 ml Medium und verteilen Sie es gleichmäßig auf eine mit Matrigel beschichtete Platte mit 6 Vertiefungen (160 ul pro Vertiefung).

EDTA-Lösung: Füge 500 ul 0.5 M EDTA (pH 8.0) zu 500 ml DPBS (-/-) hinzu. Fügen Sie 0.9 g NaCl hinzu. Filtern Sie die Lösung zum Sterilisieren und lagern Sie sie bis zu 4 Monate bei 6 °C.

Aus dem Papier:

Passage und Kolonieexpansion von humanen pluripotenten Stammzellen durch enzymfreie Dissoziation unter chemisch definierten Kulturbedingungen

Jeanette Beers,¹ Daniel R. Gulbranson,^2,3 Nicole George,⁴Lauren I. Siniscalchi,¹ Jeffrey Jones,^4,5 James A. Thomson,^2,3,6 und Guokai Chen^1,2

14 Einfrieren von hESC/iPSC

1. Schalten Sie Bio-Cool (Gefrierschrank mit kontrollierter Rate) ein und stellen Sie die Temperatur auf -7 °C ein.
2. Zellen aus dem Inkubator entfernen und Konfluenz und Morphologie unter dem Mikroskop beobachten.
3. Wenn die Vertiefungen zu 70 % konfluent sind, entfernen Sie das alte Medium und waschen Sie es einmal mit PBS (-/-) und fügen Sie dann 1 ml EDTA-Lösung (siehe Passieren mit EDTA-Lösung) pro Vertiefung hinzu.
4. Bei Raumtemperatur für 3-4 Minuten inkubieren.
5. Aspirieren Sie die EDTA-Lösung und fügen Sie 1 ml kaltes mFreSR-Medium (Kat.-Nr. 05855, Stem Cell Technologies) hinzu.
6. Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen vorsichtig anzuheben. Halten Sie die Zellen so weit wie möglich in großen Stücken und vermeiden Sie das Auf- und Abpipettieren.
7. Übertragen Sie Zellen/mFreSR mit einer Weithalsspitze in ein Kryoröhrchen. Halten Sie die Fläschchen auf Eis, bis Sie für Schritt 8 bereit sind.
8. Röhrchen in Bio-Cool stellen und 10 Minuten inkubieren.
9. Nimm flüssigen Stickstoff.
10. Säen Sie die Zellen nach 10 Minuten aus, indem Sie einen Spatel in flüssigen Stickstoff tauchen und die Seite des Kryo-Fläschchens etwa 10 bis 30 Sekunden lang berühren oder bis Sie eine Kristallform an der Seite des Kryo-Fläschchens sehen.
11. Starten Sie Programm 1, indem Sie die „PROG“-Taste drücken und durch das Programm gehen, indem Sie die Taste erneut drücken, und Sie sollten eine Rate von 0.5 °C/min sehen. , und drücken Sie dann „RUN“.
12. Sobald die Temperatur -65 °C erreicht, können die Kryo-Röhrchen in flüssigen Stickstoff überführt und gelagert werden.

Alternativen

Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Kryo-Röhrchen in einen Gefrierbehälter (Biocision-CoolCell) zu stellen und über Nacht bei -80 °C zu lagern. Bewegen Sie die Kryoröhrchen am nächsten Tag in flüssigen Stickstoff (Flüssig- oder Dampfphase).

Dr. William Stanford-2022