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Induziertes Pluripotent

Stammzellen

 

1. iPSC Hintergrundinformationen für den Nichtwissenschaftler

Stammzellen sind „unreife“ Zellen, die sich noch nicht dazu verpflichtet haben, ein einziger Zelltyp zu werden. Sie sind biegsam, weil sie das Potenzial haben, sich zu vielen verschiedenen Arten reifer Zellen im Körper zu entwickeln, beispielsweise zu Zellen, aus denen das Herz oder die Blutgefäße bestehen, sowie zu anderen Geweben und Organen. 2007 entdeckten die Forscher eine Strategie zur Erzeugung von Stammzellen im Labor, indem sie reife adulte Zellen neu programmierten, die wir üblicherweise zu Forschungszwecken züchten.1, 2 . Diese künstlich erzeugten Stammzellen werden als induzierte pluripotente Stammzellen („iPSCs“) bezeichnet. Für Progerien ist dies ein großer Durchbruch. Zum ersten Mal können Wissenschaftler nun Progeria-Stammzellen herstellen und Fragen dazu stellen, wie Stammzellen in Progeria funktionieren und sich entwickeln. Zuvor gab es keine Quelle für menschliche Progeria-Stammzellen, und daher gab es keine Informationen darüber, wie Progeria-Stammzellen im Vergleich zu Stammzellen von Menschen ohne Progeria funktionieren. Darüber hinaus können Wissenschaftler die Progeria-Stammzellen neu programmieren, um zum ersten Mal reife Progeria-Blutgefäße, Herzzellen und andere Zelltypen zu erzeugen. Bisher gab es keine Quelle für menschliche Progeria-Herz- oder Blutgefäßzellen.  Wir können jetzt Schlüssel fragen Fragen zur Herzkrankheit, die in Progerien zum frühen Tod durch Herzinfarkt und Schlaganfall führt. Wir können diese Entdeckungen mit der Herzkrankheit und dem Altern in der Allgemeinbevölkerung vergleichen und mehr darüber herausfinden, was das Altern in uns allen beeinflusst. Es wurden bereits mehrere hervorragende Studien mit Progeria-Stammzellen veröffentlicht. 3-5  Unser Ziel bei der Progeria Research Foundation ist es, mit diesem unschätzbaren Werkzeug viele weitere Entdeckungen zu ermöglichen. Eine Grundierung für Stammzellen finden Sie auf dieser Website der US-Regierung: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

  1. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M., Narita M., Ichisaka T., Tomoda K., Yamanaka S. Induktion pluripotenter Stammzellen aus adulten menschlichen Fibroblasten durch definierte Faktoren. Zelle 2007; 131: 861-872.
  2. Yu J., Vodyanik MA, Smuga-Otto K., Antosiewicz-Bourget J., Frane L., Tian S., Nie J., Jonsdottir GA, Ruotti V., Stewart R., Slukvin II., Thomson JA. Induzierte pluripotente Stammzelllinien aus menschlichen Körperzellen. Science. 2007; 318: 1917-1920.
  3. Liu GH, Barkho BZ, Ruiz S., Diep D., Qu J., Yang SL, Panopoulos AD, Suzuki K., Kurian L., Walsh C., Thompson J., Boue S., Fung HL, Sancho-Martinez I., Zhang K., Yates J., 3rd, Izpisua Belmonte JC. Zusammenfassung des vorzeitigen Alterns mit iPSCs vom Hutchinson-Gilford-Progerie-Syndrom. Natur. 2011; 472: 221-225.
  4. Von Misteli T. HGPS abgeleitete iPSCs für die Ewigkeit. Cell Stammzelle. 2011; 8: 4-6.

2. Zweck der Erzeugung und Verteilung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSC) durch die Progeria Research Foundation

Die Mission der Progeria Research Foundation ist es, Behandlungen und Heilmittel für das Hutchinson-Gilford-Progeria-Syndrom und seine altersbedingten Störungen zu entdecken. In 2009 ging PRF eine Zusammenarbeit mit einem Expertenteam von Wissenschaftlern an der Universität von Toronto, Kanada, unter der Leitung von William Stanford, PhD, ein, um hochwertige Progeria iPSCs zu generieren. Dr. Stanford ist der kanadische Forschungslehrstuhl für integrative Stammzellbiologie. Ab 2011 arbeitet PRF weiterhin mit Dr. Stanford an der Universität von Ottawa, Kanada, zusammen, wo er Professor für Zelluläre und Molekulare Medizin, Medizinische Fakultät und Senior Scientist am Sprott Center for Stem Cell Research des Ottawa Hospital Research Institute ist.

Unser Ziel ist es, Forschern auf der ganzen Welt dieses unschätzbare Werkzeug zur Verfügung zu stellen. Dieses neue Forschungsinstrument wird verwendet, um neue und innovative Forschungsergebnisse in Progerien sowie deren Beziehung zu Herzkrankheiten und Alterung zu generieren.  

3. Erzeugung von Hutchinson-Gilford-Progeria-Syndrom-induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs)

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) wurden unter Verwendung der VSVG-pseudotypisierten retroviralen Transduktion von vier menschlichen Faktoren, Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc, in Fibroblasten abgeleitet. iPSC-Kolonien wurden von Maus-Embryonal-Fibroblasten (MEFs) abgeleitet. Das verwendete Verfahren war im Wesentlichen wie zuvor beschrieben, jedoch ohne die Verwendung des EOS-Reporters (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009). 

4. Qualitätskontrolle: Validierung und Charakterisierung

Die derzeit verfügbaren Zeilen wurden mehreren Validierungsschritten unterzogen (siehe PDFs zum Herunterladen unten):

  1. Mycoplasma-Test für jede Linie: Dr. Stanfords Labor hat für jede Zelllinie eine Mycoplasma-Analyse mittels PCR durchgeführt. Zusätzlich werden die Linien nach der Expansion und vor dem Versand der Zellen erneut auf Mycoplasma getestet.
  2. Immunfärbung für Pluripotenzmarker Tra-1-60, Tra-1-81 und SSEA4.
  3. Färbung mit alkalischer Phosphatase als Indikator für die Pluripotenz
  4. Embryoidkörperbildung und anschließende Immunfärbung für Marker der drei Keimschichten. Getestete Marker waren βIII-Tubulin (Ektoderm), Glattmuskel-Actin (Mesoderm) und Gata4 oder AFP (Endoderm).
  5. Karyotypanalyse.
  6. Reexpression von Lamin A in differenzierten Zellen
  7. Teratom-Assays

Zusätzliche Validierung in Bearbeitung:
Einige Linien haben Teratom-Assays abgeschlossen, wie in den unterstützenden Daten gezeigt. Für alle anderen Linien sind Teratom-Assays in Bearbeitung und der Status wird aktualisiert, sobald diese Assays abgeschlossen sind.

5. Ursprüngliches Ausgangsmaterial, von dem diese iPS-Zellen abgeleitet wurden

iPSCs wurden von nicht transformierten Fibroblasten-Zelllinien der PRF Cell & Tissue Bank abgeleitet.

Die für alle iPS-Linien verwendete Transduktionsmethode war Retrovirus MKOS.

iPSC-Leitungs-IDMutationGeschlecht und SpendenalterZelltyp des Ursprungs Klicken Sie hier.Unterstützende Daten
HGADFN003 iPS 1B LMNAExon 11,
1824 C> T
Männchen 2yr 0mo Dermale Fibroblasten
HGADFN003
003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C LMNA Exon 11,
1824 C> T
Männchen 2yr 0mo Dermale Fibroblasten
HGADFN003
003 iPS1C
HGDFN003
iPS 1D
LMNA Exon 11,
1824 C> T
Männchen 2yr 0mo Dermale Fibroblasten
HGADFN003
003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J LMNA Exon 11, 1824 C> TMännchen 8yr 5moDermale Fibroblasten HGADFN167167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q LMNA Exon 11, 1824 C> TMännchen 8yr 5moDermale Fibroblasten HGADFN167167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B Mutter von HGADFN167 (nicht betroffen)Weibchen 37yr 10moDermale Fibroblasten
HGMDFN090
090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C Mutter von HGADFN167 (nicht betroffen)Weibchen 37yr 10moDermale Fibroblasten
HGMDFN090
090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2Vater von HGADFN167 (nicht betroffen)Männchen 40yr
5mo
Dermale Fibroblasten HGFDFN168168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1PVater von HGADFN167 (nicht betroffen)Männchen 40yr
5mo
Dermale Fibroblasten
HGFDFN168
168 iPS1P

6. Tragen Sie sich in unsere E-Mail-Liste ein, um zukünftige iPSC-Updates und neue Zelllinien zu erhalten

Wir generieren weiterhin iPSC-Leitungen. Wenn Sie regelmäßig über iPSCs in der PRF Cell & Tissue Bank informiert werden möchten, klicken Sie auf unsere E-Mail-Liste hier

7. Fragen?

Bei Fragen oder Wünschen wenden Sie sich bitte an Leslie Gordon, MD, PhD, Medical Director, unter lgordon@progeriaresearch.org oder 978-535-2594

8. Bestellung von iPS-Zelllinien

In 2014 hat PRF eine Richtlinie eingeführt, die keine Änderungen an unserem MTA vorsieht. Dies ist das Ergebnis jahrelanger vertraglicher Vereinbarungen mit 12-Forschungsteams, die an Einrichtungen in 70-Ländern arbeiten. PRF und sein Anwalt haben die in diesem Zeitraum aufgetretenen Probleme berücksichtigt und die Vereinbarung dementsprechend überarbeitet, was unserer Meinung nach zu fairen und angemessenen Bedingungen geführt hat.

Bei Institutionen oder Fragen der US-Bundesregierung wenden Sie sich bitte an Wendy Norris unter: wnorris@lifespan.org or 401-274-1122 x 48063.

Schritt 1: Schließen Sie einen Antrags- und Materialtransfervertrag ab

Antrag und Vereinbarung für nichtstaatliche Institutionen

Materialtransfervertrag für nichtstaatliche Institutionen *

Schritt 2: Senden Sie den ausgefüllten Antrag und den Materialtransfervertrag an PRF unter info@progeriaresearch.org. Nach der Genehmigung erhalten Sie eine E-Mail, in der Ihre Bestellung und das voraussichtliche Versanddatum bestätigt werden. 

Schritt 3: Das Labor von Dr. Stanford verteilt derzeit Leitungen in gefrorenen Kryovials. Sein Labor wird Ihnen nach Versand der Kultur eine E-Mail mit Versand- und Nachverfolgungsinformationen senden. Unerfahrene Forscher werden angewiesen, Schulungen in speziellen Kursen zu erhalten, die für die Arbeit mit menschlichen embryonalen Stammzellen / iPSCs unerlässlich sind.

Schritt 4: Die Universität von Ottawa berechnet 100.00 USD(USD) pro iPSC-Leitung zuzüglich etwaiger Kurierkosten und sendet Ihnen direkt eine Rechnung.

9. Herstellung von HGPS- und Kontroll-iPS-Zellkulturmedien

iPSC und ESCs müssen entweder mit TeSR-E8 von Stem Cell Technologies (Kat. Nr. 05990) oder Essential 8-Medium von ThermoFisher Scientific (Kat. Nr. A1517001) gefüttert werden. Bitte befolgen Sie die Empfehlungen des Lieferanten zur Lagerung.

10.Preparing Madrigal Plates

Hinweis: Alle Schritte mit Matrigel sollten so schnell wie möglich durchgeführt werden und so kalt wie möglich bleiben.

  1. Auftauen der Matrigelflasche (10ml) bei 4C.
  2. Nehmen Sie eine Matrigelflasche und geben Sie 10ml kaltes DMEM / F12-Medium hinzu.
  3. Aliquotieren Sie 1ml Matrigel in vorgekühlten 15ml Falcon-Röhrchen.
  4. Alle Aliquots bei -20C einfrieren
  5. Um eine Matrigelplatte herzustellen, entfernen Sie ein Aliquot Matrigel (1ml) von -20C und fügen Sie 18ml kaltes DMEM / F12 hinzu. Lassen Sie das Pellet auftauen und mischen Sie es nach dem Auftauen gut (ohne Blasenbildung) und plattieren Sie es (1ml / Well für 6-Well-Platte, 0.5ml / Well für 12-Well-Platte, 0.25ml / Well für 24-Well-Platte). Diese Platten sind mit MG1 gekennzeichnet.
  6. Wenn Sie die Platte sofort verwenden, lassen Sie sie 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen und beobachten Sie das Matrigel unter dem Mikroskop. Matrigel sollte gut verteilt und nicht „klumpig“ sein.
  7. Sobald die 1-Stunde verstrichen ist, wird das Matrigel auf eine zweite Platte übertragen (diese Platte ist mit MG2 gekennzeichnet). Bei sofortiger Verwendung 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
  8. Wenn Sie die Platten zu einem anderen Zeitpunkt verwenden, wickeln Sie den Rand der Platte mit Paraffin ein und lagern Sie sie bei 4 Grad.


Matrigel - BD / Fisher, Katze # CB-40230
DMEM / F12 - Life Technologies, Kat.-Nr. 11330-057

Dr. William Stanford-2018

11. Auftauen von hESCs und iPSCs

Auftauen von ES- oder iPS-Zellen (pro Kryo-Fläschchen)

  1. Nehmen Sie die Matrigelplatte aus 4C und erwärmen Sie sie eine Stunde lang auf Raumtemperatur oder stellen Sie eine frische Matrigelplatte her (Siehe Vorbereitung des Matrigelplattenprotokolls).
  2. Erwärmen Sie 4ml PSC-Medium (pluripotent stem cell media) in einem 15ml falcon tube.
  3. Entfernen Sie die Zellen aus dem Gefrierschrank und schwenken Sie sie in einem Wasserbad mit 37-Grad, bis nur noch ein kleines Stück Eis übrig ist. Dieser Schritt muss schnell erledigt werden.
  4. Ethanol-Zellröhrchen und Falcon-Medienröhrchen in die Haube stellen.
  5. Verwenden Sie eine 1ml-Weithalsspitze, um langsam Zellen zu 4ml vorgewärmter Medien hinzuzufügen
  6. Bei 850rpm für 5min drehen
  7. Überstand entfernen
  8. Fügen Sie 2 ml PSC-Medium hinzu und brechen Sie mit einer breiten Mundspitze Klumpen auf. Übertragen Sie das Medium in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und geben Sie 2 μl ROCK-Inhibitor (Y27632, Endkonzentration 10 μM) hinzu.
  9. Entfernen Sie das Medium nach 24 Stunden und fügen Sie 2ml PSC-Medium hinzu (für eine 6-Vertiefung, 1ml für eine 12-Vertiefung und 0.5ml für eine 24-Vertiefungsplatte). Sehen Ernte und Pflege für hESC / iPSC Protokoll

PSC-Medien
TeSR-E8 von Stem Cell Technologies, Katalog # 05990 oder Essential 8 Medium von ThermoFisher Scientific, Katalog # A1517001

Was ist ROCK Inhibitor Y27632?
ROCK Inhibitor Y27632 ist ein selektiver Inhibitor der Rhoassoziierten Kinase p160ROCK. Die Behandlung mit dem ROCK-Inhibitor Y27632 verhindert die dissoziationsinduzierte Apoptose von humanen embryonalen Stammzellen (hESC) und humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC), erhöht die Überlebensrate und erhält die Pluripotenz während der Subkultivierung und des Auftauens von hESCs und hiPSCs. Es wurde auch gezeigt, dass der ROCK-Inhibitor Y27632 die Überlebensrate von Stammzellen während der Kryokonservierung erhöht.

Dr. William Stanford-2018

12.Harvesting und Pflege von hESCs und iPSCs

  1. Entfernen Sie das Medium aus 4C und legen Sie es in das 37C-Wasserbad.
  2. Sehen Sie sich die Zellen am Tag nach dem Auftauen unter dem Mikroskop an, um die Überlebensrate zu bestimmen. (Wenn die Zellen nur mit mFreSR eingefroren wurden, beträgt die Überlebensrate ca. 20%, wenn die Zellen mit der Bio-Cool-Überlebensrate ca. 60% eingefroren wurden).
  3. Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen und pipettieren Sie 2ml (für eine 6-Vertiefung, 1ml für eine 12-Vertiefung und 0.5ml für eine 24-Vertiefungsplatte) mit frischem PSC-Medium pro Vertiefung.
  4. Legen Sie die Platte in den 37C-Inkubator (hypoxischer Zustand: 10% CO2 und 5% O2).
  5. Die Zellen werden jeden Tag für die nächsten 3-5-Tage gefüttert, bis 80% konfluent ist.
  6. Die Zellen sollten beobachtet und von eventuell wachsenden differenzierten Zellen gereinigt werden.
  7. Verwenden Sie zum Reinigen der Zellen die Entnahmehaube und "entfernen" Sie differenzierte Zellen mit einer Pipettenspitze.
  8. Sobald die Zellen gereinigt sind, wird das Medium wie oben beschrieben gewechselt.

(Siehe Einfrieren von hESC / iPSC oder Bestehen von hESC / iPSC)

Anmerkung
PSC-Medien erwiesen sich in einer hypoxischen Umgebung als effizienter. Wir haben auch beobachtet, dass weniger Differenzierung auftritt, wenn Zellen in hypoxischen Inkubatoren gegenüber normoxischen gezüchtet werden. Auch beim Aussäen von Zellen ist die Überlebensrate bei Verwendung eines hypoxischen Inkubators besser.

Normoxisch: 5% CO2
Hypoxisch: 5% O2, 10% CO2

Dr. William Stanford-2018

13.Passaging mit EDTA-Lösung

  1. 2ml PSC-Medium auf eine mit 6-Well-Matrigel beschichtete Platte geben und beiseite stellen.
  2. Nehmen Sie die zu passagierende Platte, entfernen Sie das Medium aus der Vertiefung und waschen Sie es einmal mit 1ml PBS (- / -).
  3. 1 ml der EDTA-Lösung in die Vertiefung geben und 3-4 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Bewegen Sie die Platte nicht, da sich die Zellen lösen können.
  4. Sobald 4 min. Entfernen Sie die EDTA-Lösung und fügen Sie 1ml des PSC-Mediums hinzu. Lassen Sie EDTA nicht länger als 4 min auf den Zellen, da dies zum Abheben der Zellen führt.
  5. Kratzen Sie die Zellen (mit Cell Scrapper) ab und teilen Sie die Zellen in die 6-Vertiefungen Ihrer Platte, die PSC-Medien enthält (ich habe 160ul in jede Vertiefung aufgenommen). Vermeiden Sie es, die Teile in sehr kleine Stücke zu zerbrechen. Versuchen Sie, große Stücke zu behalten. Verwenden Sie vorzugsweise eine Weithalspipettenspitze.

HINWEIS: Sobald die Zellen abgekratzt wurden, möchten Sie sie so schnell wie möglich auf die neue Platte übertragen, da sich die Zellen schnell (innerhalb von 5min) wieder verbinden.

Wenn EDTA länger als 4mins in den Zellen verbleibt. Die Zellen können sich ablösen. In diesem Fall verschrotten Sie einfach die Zellen und sammeln Sie sie in einem 15ml-Falken mit 4ml PSC-Medien. Spin Zellen bei 850rpm für 5 min. Das Pellet mit 1ml Medium resuspendieren und gleichmäßig auf eine mit 6-Well-Matrigel beschichtete Platte (160ul pro Well) verteilen.

EDTA-Lösung: 500 ul 0.5 M EDTA (pH 8.0) in 500 ml DPBS (- / -) geben. 0.9 g NaCl zugeben und die Osmolarität auf 340 mOsm einstellen. Filtriere die Lösung zum Sterilisieren und lagere sie bis zu 4 Monate bei 6 ° C. Wir wollen die geringste Störung für die Zellen während der Dissoziation, daher hat die EDTA-Lösung die gleiche Osmolarität wie das PSC-Medium.

Aus dem Papier:
Passage und Kolonieexpansion von humanen pluripotenten Stammzellen durch enzymfreie Dissoziation unter chemisch definierten Kulturbedingungen
Jeanette Beers,1 Daniel R. Gulbranson,2,3 Nicole George,4Lauren I. Siniscalchi,1 Jeffrey Jones,4,5 James A. Thomson,2,3,6 und Guokai Chen1,2

14.Frostende hESCs und iPSCs

  1. Schalten Sie Bio-Cool (kontrollierte Gefrierrate) ein und stellen Sie die SP-Temperatur auf -7C ein.
  2. Entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator und beobachten Sie die Konfluenz und Morphologie unter dem Mikroskop.
    Anmerkung Auf der Suche nach ~ 80% Konfluenz
  3. Wenn es konfluent ist, entfernen Sie das alte Medium und waschen Sie es einmal mit PBS (- / -). Fügen Sie dann 1 ml EDTA-Lösung (siehe Passieren mit EDTA-Lösung) pro Well hinzu.
  4. Bei Raumtemperatur für 3-4 Minuten inkubieren.
  5. Die EDTA-Lösung absaugen und 1 ml mFreSR-Medium (Kat.-Nr. 05855, Stem Cell Technologies) hinzufügen.
  6. Entfernen Sie die Zellen mit einem Zellschaber (vorsichtig) aus dem Well.
  7. Übertragen Sie Zellen / mFreSR mit einer weiten Mundspitze in ein Kryoröhrchen.
  8. Röhrchen in Bio-Cool legen und für 10min inkubieren.
  9. Nimm flüssigen Stickstoff.
  10. Nach 10min. Keimen Sie die Zellen, indem Sie einen Spatel in flüssigen Stickstoff tauchen und die Seite des Kryo-Fläschchens etwa 10 Sekunden lang berühren oder bis Sie eine Kristallform auf der Seite des Kryo-Fläschchens sehen.
  11. Starten Sie das Programm 1 durch Drücken der Taste „PROG“ und durch erneutes Drücken der Taste durchlaufen Sie das Programm. Die Rate 0.5C / min sollte angezeigt werden. und drücken Sie dann „RUN“.
  12. Sobald die Temperatur -65C erreicht hat, können die Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff überführt und gelagert werden.

Alternativen
1-Eine andere Möglichkeit ist, die Kryoröhrchen in einen Gefrierbehälter (Biocision-CoolCell) zu legen und über Nacht bei -80C zu lagern. Kryoröhrchen am nächsten Tag in flüssigem Stickstoff lagern.

Dr. William Stanford-2018