خلية لمفاوية
بروتوكولات الثقافة
بروتوكول لزراعة الخلايا الليمفاوية المتحولة
بروتوكول زراعة الخلايا الليمفاوية
وسط النمو
RPMI 1640 – ThermoFisher # 11875
مصل الجنين البقري 15% (FBS) – ThermoFisher #10437-028
1% (1X) بنسلين-ستربتوميسين (اختياري) – ThermoFisher #15140-122
ملاحظات عامة
- يجب دائمًا موازنة وسط النمو في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و5% CO2 لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام
- استخدم دائمًا القوارير ذات الأغطية ذات التهوية
- احتضن القارورة دائمًا في وضع مستقيم
- لا ينبغي استخدام أكثر من 20 مل في قارورة T25
إذابة الخلايا المجمدة
سيتم استلام الخلايا المجمدة في أجزاء صغيرة سعة 1 مل على الجليد الجاف. احتفظ بالخلايا مجمدة حتى تذوب لزراعة الخلايا أو ضعها في مخزن النيتروجين السائل إذا لم تبدأ الزراعة على الفور. ومع ذلك، يوصى بأنه إذا كنت ستخزن الخلايا لاستخدامها لاحقًا، فقم بتنمية مخزونات طازجة وتجميد أمبولات متعددة. يتم حفظ الخلايا بالتبريد في 45% RPMI-1640 و50% FBS و5% DMSO (درجة زراعة الأنسجة).
-
- ضع 10 مل من مصل الجنين البقري (FBS) RPMI-1640، 15%، ± المضادات الحيوية في قارورة T-25 ذات غطاء مهوى.
- اسمح للوسائط بالتوازن في حاضنة مرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5% CO2 في الهواء لمدة 30 دقيقة. يجب تحضين القوارير في وضع مستقيم.
- قم بإذابة كل أمبولة أو قارورة من الخلايا المجمدة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية أو في كأس من الماء الفاتر، واحدة تلو الأخرى.
- قم بتنظيف الجزء الخارجي من الأمبولة أو القارورة بسرعة باستخدام الإيثانول 70%. إذا كانت الخلايا في أمبولة زجاجية، فقم بكسر الأمبولة بعناية مع الحرص على حماية الأصابع من الزجاج المكسور.
- قم بإزالة 1 مل من الخلايا المجمدة باستخدام ماصة معقمة وضعها في قارورة T-25 مع 10 مل من الوسط. قم بتسمية القارورة بوضوح لتحديد كل سلالة من الخلايا.
- ضع القارورة في حاضنة مرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5% CO2 في الهواء. يجب أن يتم تحضين القوارير في وضع مستقيم.
- بعد مرور 24 ساعة، قم بإزالة 5 مل من الوسط من الأعلى دون إزعاج الخلايا الليمفاوية المستقرة في قاع القارورة واستبدلها بـ 5 مل من الوسط المسخن مسبقًا.
- المضي قدما في بروتوكول زراعة الخلايا الليمفاوية.
زراعة الخلايا الليمفاوية
-
- بعد ثلاثة إلى أربعة أيام من إذابة الجليد، قم بعدّ الخلايا. الخلايا غير ملتصقة وتنمو في كتل. قم بتفتيت الكتل عن طريق التقطير اللطيف.
- عد الخلايا.
- من الناحية المثالية، يجب ألا يتجاوز تركيز الخلايا 2 × 106 خلايا/مل.
- اعتمادًا على تركيز الخلية، قم بإعادة تغذية الخلايا أو تقسيمها أو تجميدها.
- قم بإعادة التغذية بإضافة 5-6 مل من وسط النمو المتوازن.
- زرع الثقافات الجديدة بما لا يقل عن 2 × 105 خلايا/مل.
- يجب تجميد الخلايا عند درجة حرارة 5 × 10 تقريبًا6 خلايا/مل. اتبع بروتوكول تجميد الخلايا.
تجميد الخلايا الليمفاوية
-
- يجب تجميد الخلايا عند درجة حرارة 5 × 10 تقريبًا6 خلايا/مل.
- نقل الحجم المناسب من الخلايا إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 أو 50 مل.
- قم بالطرد المركزي عند 4 درجات مئوية عند 100 × ج لمدة 10 دقائق.
- قم بإزالة الوسط ثم أعد تعليقه في حجم مناسب من وسط التجميد البارد.
- نقل 1 مل من الخلايا إلى كل زجاجة مبردة.
- ضع القوارير المبردة في حجرة التجميد ثم ضع الحجرة في الفريزر عند درجة حرارة -80 درجة مئوية طوال الليل.
- انقل القوارير المبردة إلى النيتروجين السائل في اليوم التالي.
لمزيد من المعلومات يرجى الاتصال:
ليزلي ب. جوردون، دكتور في الطب، دكتور في الفلسفة
أستاذ أبحاث طب الأطفال كلية الطب وارن ألبرت بجامعة براون وقسم طب الأطفال، مستشفى هاسبرو للأطفال، بروفيدنس، رود آيلاند قسم التخدير، مستشفى الأطفال بوسطن وكلية الطب بجامعة هارفارد، بوسطن، ماساتشوستس المدير الطبي لمؤسسة أبحاث الشيخوخة المبكرة
الهاتف: 978-535-2594
فاكس: 508-543-0377
لجوردون@progeriaresearch.org
ويندي نوريس
الهاتف: 401-274-1122 x 48063
ونوريس@brownhealth.org