من شحنة الخلايا المجمدة

سيتم استلام الخلايا المجمدة في قسامات 1 ml على الثلج الجاف. حافظ على تجميد الخلايا حتى يتم إذابتها لاستزراع الخلية أو وضعها في تخزين النيتروجين السائل إذا لم تبدأ الثقافات على الفور. ومع ذلك ، فمن المستحسن أنه إذا كنت ستقوم بتخزين الخلايا لاستخدامها لاحقًا ، فأنمو مخزونًا جديدًا وتجميد عدة أمبولات. يتم الحفاظ على الخلايا في 45٪ RPMI-1640 ، 50٪ مصل عجل الجنين ، و 5٪ DMSO (درجة زراعة الأنسجة).

1. ضع 10 مل من RPMI-1640 ، مصل العجل الجنيني 15٪ (FCS) ، ± المضادات الحيوية في قارورة T-25.
2. اسمح للوسائط بالتوازن في حاضنة 37 ° C المرطبة باستخدام هواء 5٪ CO 2in لمدة 30 دقيقة.
3. ذوبان الجليد كل أمبولات من الخلايا المجمدة في حمام مائي 37 ° C أو دورق من الماء الفاتر ، واحدة في وقت واحد.
4. قم بتنظيف الجزء الخارجي من الأمبولة بسرعة باستخدام وسادة إعداد الأيزوبروبانول المعقمة ، ثم لف الوسادة الإعدادية حول الأمبول لحماية الأصابع وكسر الختم على الأمبول داخل غطاء أمان بيولوجي.
5. إزالة 1 مل من الخلايا المجمدة مع الماصة باستور الزجاج المعقم ومكان في قارورة T-25 مع 10 مل من المتوسط. من الواضح تسمية قارورة لتحديد كل خط الخلية.
6. وضع الخلايا في حاضنة ترطيب 37 ° C مع 5٪ CO 2in الهواء.
7. بعد ساعات 24 ، قم بإزالة 5 ml من الوسط من الأعلى دون إزعاج الخلايا اللمفاوية المستقرة في قاع القارورة واستبدالها بـ 5 ml من الوسط المُسخّن مسبقًا.
8. قم بتغذية الخلايا بـ 5-6 مل من وسط جديد كل 3-4 أيام وقسمها إلى مزارع جديدة حسب الحاجة.

من شحنة من الثقافات الحية

1. سيتم استلام الثقافات اللمفاوية الحية في قوارير T-25 مملوءة إلى الأعلى مع RPMI-1640 ، 15٪ FCS ، 1٪ Penicillin-Streptomycin (Gibco). سوف تكون القبعات ضيقة ومختومة مع بارافيلم.
2. إزالة parafilm.
3. مكان الثقافات في حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 في الهواء والسماح للخلايا لتستقر (20 - 30 دقيقة).
4. باستخدام ماصة معقمة ، قم بإزالة الكل باستثناء 10-15 مل من الوسط وتجاهل.
5. ضع أغطية الظهر على القوارير بشكل بسيط للسماح بتبادل الغاز (تحقق للتأكد من عدم وجود وسائط بها. إذا كنت قد ترغب في نقلها إلى قارورة جديدة.) ضع الثقافات في الحاضنة مع 5٪ CO 2in الهواء. يجب أن يتعافوا في يوم أو يومين.
6. قم بتغذية الخلايا بوسط جديد كل 3-4 أيام عن طريق إعادة تعليق تجمعات الخلية وإزالة 50-60٪ من الحجم واستبدالها بوسائط جديدة. يمكن استخدام الخلايا التي تمت إزالتها من القارورة لبدء ثقافات جديدة حسب الحاجة.

ويندي نوريس