Від відвантаження заморожених клітин

Заморожені клітини будуть отримані в аликвотах 1 мл на сухому льоду. Зберігайте клітини замороженими до відтавання для клітинної культури або поміщайте їх у сховище рідкого азоту, якщо не починати культуру відразу. Однак рекомендується, якщо ви збираєтеся зберігати клітини для подальшого використання, вирощуйте свіжі запаси та заморожуйте кілька ампул. Клітини криоконсервуються у сироватці теляти 45% RPMI-1640, 50% плоду і 5% DMSO (сорт культури тканин).

1. Помістіть 10 мл RPMI-1640, сироватку теляти 15% (FCS), ± антибіотики в колбу T-25.
2. Дозвольте носіям рівноважити у зволоженому інкубаторі 37 ° C із повітрям 5% CO 2in протягом 30 хв.
3. Розморожуйте кожну ампулу замерзлих клітин на водяній бані 37 ° C або в склянці з теплою водою по одній.
4. Швидко очистіть зовнішню сторону ампули стерильною підкладкою для ізопропанолу, після чого обмотайте підготовчу прокладку навколо ампули, щоб захистити пальці та розтріскувати пломбу на ампулі всередині біологічного витяжки.
5. Видаліть 1 мл заморожених клітин зі стерильною скляною піпеткою Пастера і помістіть у колбу T-25 з 10 мл середовища. Чітка мітка для мітки для ідентифікації кожної лінії комірок
6. Помістіть осередки у зволожений інкубатор 37 ° C з 5% CO 2 у повітрі.
7. Після закінчення годин 24 видаліть 5 мл середовища зверху, не порушуючи осілих лімфоцитів на дні колби, і замініть 5 мл попередньо прогрітого середовища.
8. Годують клітини 5 - 6 мл свіжого середовища кожні 3 - 4 дні і, за потреби, ділять на нові культури.

Від відправлення живих культур

1. Живі культури лімфоцитів будуть отримані в колбах T-25, наповнених зверху RPMI-1640, 15% FCS, 1% пеніциліну-стрептоміцину (Gibco). Кришки будуть щільно зафіксовані парафільмом.
2. Видаліть парафільм.
3. Помістіть культури у зволожений інкубатор при 37 ° C з 5% СО2 на повітрі і дайте клітинам осісти (20 - 30 хвилин).
4. За допомогою стерильної піпетки видаліть все середовище, крім 10 - 15 мл, і викиньте.
5. Поставте кришки назад на колби, трохи розпушені, щоб забезпечити обмін газами (переконайтесь, щоб переконайтеся, що нитки на кришках не містять носіїв. Якщо так, можливо, ви захочете перенести їх у нову колбу.) Помістіть культури назад в інкубатор з 5% CO 2in повітря. Вони повинні одужати через день-два.
6. Годуйте клітини свіжим середовищем кожні 3 - 4 дні, ресуспендуючи клітинні агрегати та видаляючи 50 -60% об'єму та замінюючи свіжими середовищами. Клітини, вилучені з колби, можуть використовуватися для ініціювання нових культур за потреби.

Венді Норріс