Обрати сторінку

Клітина лімфобласта

Протоколи культури

 

Протокол культивування трансформованих лімфоцитів

Протокол культивування лімфобластів

Середній ріст

RPMI 1640 – ThermoFisher # 11875
15% Фетальна бичача сироватка (FBS) – ThermoFisher #10437-028
1% (1X) пеніцилін-стрептоміцин (опціонально) – ThermoFisher #15140-122

Загальні примітки

  • Середовище росту завжди має бути врівноважене в інкубаторі при 37°C, 5% CO2 протягом 30 хвилин перед використанням
  • Завжди використовуйте колби з вентильованими кришками
  • Завжди інкубуйте колбу у вертикальному положенні
  • Не більше 20 мл слід використовувати в колбі Т25

Розморожування заморожених клітин

Заморожені клітини будуть отримані аликвотами по 1 мл на сухому льоду. Зберігайте клітини в замороженому стані до розморожування для культивування клітин або помістіть їх у сховище рідкого азоту, якщо ви не починаєте культивування відразу. Однак, якщо ви збираєтеся зберігати клітини для подальшого використання, рекомендується виростити свіжі запаси та заморозити кілька ампул. Клітини кріоконсервовані в 45% RPMI-1640, 50% FBS і 5% DMSO (клас тканинної культури).

    1. Помістіть 10 мл RPMI-1640, 15% фетальної сироватки великої рогатої худоби (FBS), ± антибіотиків у колбу Т-25 з вентильованою кришкою.
    2. Дайте середовищу врівноважитись у зволоженому інкубаторі при 37°C з 5% CO2 на повітрі протягом 30 хв. Колби повинні інкубуватися у вертикальному положенні.
    3. Розморожуйте кожну ампулу або флакон із замороженими клітинами на водяній бані при 37 °C або в склянці з теплою водою, по одній.
    4. Швидко очистіть зовнішню сторону ампули або флакона етанолом 70%. Якщо клітини знаходяться в скляній ампулі, обережно розбийте ампулу, не забудьте захистити пальці від осколків скла.
    5. Стерильною піпеткою відберіть 1 мл заморожених клітин і помістіть у колбу Т-25 з 10 мл середовища. Чітко позначте колбу, щоб ідентифікувати кожну лінію клітин.
    6. Помістіть колбу в зволожений інкубатор при 37 °C з 5% CO2 в повітрі. Колби повинні інкубуватися у вертикальному положенні.
    7. Через 24 години зніміть 5 мл середовища зверху, не турбуючи лімфоцити, що осіли на дні колби, і замініть 5 мл попередньо підігрітого середовища.
    8. Продовжуйте протокол культивування клітин лімфобласту.

Культура лімфобластів

    1. Через три-чотири дні після розморожування підрахуйте клітини. Клітини не злипаються і ростуть у вигляді згустків. Розбийте грудки обережним піпетуванням.
    2. Порахувати клітини.
    3. В ідеалі концентрація клітин не повинна перевищувати 2 х 106 клітин/мл.
    4. Залежно від концентрації клітин повторно згодовуйте, розщеплюйте або заморожуйте клітини.
    5. Поповнюйте, додаючи 5-6 мл врівноваженого середовища для росту.
    6. Висівайте нові культури не менше ніж 2 х 105 клітин/мл.
    7. Клітини слід заморозити приблизно 5 x 106 клітин/мл. Дотримуйтесь протоколу заморожування клітин.

Заморожування лімфобластів

    1. Клітини слід заморозити приблизно 5 x 106 клітин/мл.
    2. Перенесіть відповідний об’єм клітин у конічну пробірку на 15 або 50 мл.
    3. Центрифугувати при 4°C при 100 x g протягом 10 хвилин.
    4. Видаліть середовище та ресуспендуйте у відповідному об’ємі холодного середовища для заморожування.
    5. Перенесіть 1 мл клітин у кріопробірку.
    6. Помістіть кріопробірки в морозильну камеру та помістіть камеру в морозильну камеру -80°C на ніч.
    7. Наступного дня перемістіть кріопробірки в рідкий азот.

Для отримання додаткової інформації звертайтеся до:

Леслі Б. Гордон, доктор медичних наук, доктор філософії

Професор педіатричних досліджень Уоррен Альперт, медична школа Університету Брауна та кафедра педіатрії, дитяча лікарня Хасбро, Провіденс, штат Род-Айленд, відділ анестезії, дитяча лікарня Бостона та Гарвардська медична школа, Бостон, медичний директор, Фонд досліджень прогерії

Телефон: 978-535-2594
Факс: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

Венді Норріс
PRF Банк клітин і тканин
Телефон: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org
ukUkrainian