Клітина лімфобласта
Протоколи культури
Протокол культивування трансформованих лімфоцитів
Протокол культивування лімфобластів
Середній ріст
RPMI 1640 – ThermoFisher # 11875
15% Фетальна бичача сироватка (FBS) – ThermoFisher #10437-028
1% (1X) пеніцилін-стрептоміцин (опціонально) – ThermoFisher #15140-122
Загальні примітки
- Середовище росту завжди має бути врівноважене в інкубаторі при 37°C, 5% CO2 протягом 30 хвилин перед використанням
- Завжди використовуйте колби з вентильованими кришками
- Завжди інкубуйте колбу у вертикальному положенні
- Не більше 20 мл слід використовувати в колбі Т25
Розморожування заморожених клітин
Заморожені клітини будуть отримані аликвотами по 1 мл на сухому льоду. Зберігайте клітини в замороженому стані до розморожування для культивування клітин або помістіть їх у сховище рідкого азоту, якщо ви не починаєте культивування відразу. Однак, якщо ви збираєтеся зберігати клітини для подальшого використання, рекомендується виростити свіжі запаси та заморозити кілька ампул. Клітини кріоконсервовані в 45% RPMI-1640, 50% FBS і 5% DMSO (клас тканинної культури).
-
- Помістіть 10 мл RPMI-1640, 15% фетальної сироватки великої рогатої худоби (FBS), ± антибіотиків у колбу Т-25 з вентильованою кришкою.
- Дайте середовищу врівноважитись у зволоженому інкубаторі при 37°C з 5% CO2 на повітрі протягом 30 хв. Колби повинні інкубуватися у вертикальному положенні.
- Розморожуйте кожну ампулу або флакон із замороженими клітинами на водяній бані при 37 °C або в склянці з теплою водою, по одній.
- Швидко очистіть зовнішню сторону ампули або флакона етанолом 70%. Якщо клітини знаходяться в скляній ампулі, обережно розбийте ампулу, не забудьте захистити пальці від осколків скла.
- Стерильною піпеткою відберіть 1 мл заморожених клітин і помістіть у колбу Т-25 з 10 мл середовища. Чітко позначте колбу, щоб ідентифікувати кожну лінію клітин.
- Помістіть колбу в зволожений інкубатор при 37 °C з 5% CO2 в повітрі. Колби повинні інкубуватися у вертикальному положенні.
- Через 24 години зніміть 5 мл середовища зверху, не турбуючи лімфоцити, що осіли на дні колби, і замініть 5 мл попередньо підігрітого середовища.
- Продовжуйте протокол культивування клітин лімфобласту.
Культура лімфобластів
-
- Через три-чотири дні після розморожування підрахуйте клітини. Клітини не злипаються і ростуть у вигляді згустків. Розбийте грудки обережним піпетуванням.
- Порахувати клітини.
- В ідеалі концентрація клітин не повинна перевищувати 2 х 106 клітин/мл.
- Залежно від концентрації клітин повторно згодовуйте, розщеплюйте або заморожуйте клітини.
- Поповнюйте, додаючи 5-6 мл врівноваженого середовища для росту.
- Висівайте нові культури не менше ніж 2 х 105 клітин/мл.
- Клітини слід заморозити приблизно 5 x 106 клітин/мл. Дотримуйтесь протоколу заморожування клітин.
Заморожування лімфобластів
-
- Клітини слід заморозити приблизно 5 x 106 клітин/мл.
- Перенесіть відповідний об’єм клітин у конічну пробірку на 15 або 50 мл.
- Центрифугувати при 4°C при 100 x g протягом 10 хвилин.
- Видаліть середовище та ресуспендуйте у відповідному об’ємі холодного середовища для заморожування.
- Перенесіть 1 мл клітин у кріопробірку.
- Помістіть кріопробірки в морозильну камеру та помістіть камеру в морозильну камеру -80°C на ніч.
- Наступного дня перемістіть кріопробірки в рідкий азот.
Для отримання додаткової інформації звертайтеся до:
Леслі Б. Гордон, доктор медичних наук, доктор філософії
Професор педіатричних досліджень Уоррен Альперт, медична школа Університету Брауна та кафедра педіатрії, дитяча лікарня Хасбро, Провіденс, штат Род-Айленд, відділ анестезії, дитяча лікарня Бостона та Гарвардська медична школа, Бостон, медичний директор, Фонд досліджень прогерії
Телефон: 978-535-2594
Факс: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
Венді Норріс
Телефон: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org