لمفوبلاسٹ سیل
کلچر پروٹوکولز
پروٹوکول برائے کلچرنگ ٹرانسفارمڈ لیمفوسائٹس
لیمفوبلاسٹس کی ثقافت کا پروٹوکول
گروتھ میڈیم
RPMI 1640 - ThermoFisher # 11875
15% فیٹل بووائن سیرم (FBS) - تھرمو فشر #10437-028
1% (1X) Penicillin-Streptomycin (اختیاری) - ThermoFisher #15140-122
عمومی نوٹس
- گروتھ میڈیم کو ہمیشہ انکیوبیٹر میں 37 ° C، 5% CO پر متوازن ہونا چاہئے2 استعمال سے پہلے 30 منٹ کے لئے
- ہمیشہ وینٹیڈ کیپس کے ساتھ فلاسکس استعمال کریں۔
- فلاسک کو ہمیشہ سیدھی پوزیشن میں لگائیں۔
- T25 فلاسک میں 20 ملی لیٹر سے زیادہ استعمال نہیں کرنا چاہئے۔
منجمد خلیوں کو پگھلانا
منجمد خلیات خشک برف پر 1 ملی لیٹر ایلی کوٹس میں وصول کیے جائیں گے۔ سیل کلچر کے لیے پگھلنے تک سیلز کو منجمد رکھیں یا مائع نائٹروجن اسٹوریج میں رکھیں اگر کلچرز ابھی شروع نہ ہوں۔ تاہم، یہ سفارش کی جاتی ہے کہ اگر آپ بعد میں استعمال کے لیے خلیوں کو ذخیرہ کرنے جا رہے ہیں، تو تازہ ذخیرہ بڑھائیں اور متعدد ampoules کو منجمد کریں۔ خلیات 45% RPMI-1640، 50% FBS، اور 5% DMSO (ٹشو کلچر گریڈ) میں کریوپریزرڈ ہیں۔
-
- RPMI-1640 کے 10 ملی لیٹر، 15% فیٹل بووائن سیرم (FBS)، ± اینٹی بائیوٹکس کو T-25 فلاسک میں وینٹیڈ کیپ کے ساتھ رکھیں۔
- میڈیا کو 5% CO کے ساتھ 37 ° C نمی والے انکیوبیٹر میں متوازن ہونے دیں۔2 30 منٹ کے لئے ہوا میں. فلاسکس کو سیدھی پوزیشن میں لگانا چاہیے۔
- ہر ایک ایمپول یا منجمد خلیوں کی شیشی کو 37 ° C پانی کے غسل میں یا نیم گرم پانی کے ایک بیکر میں، ایک وقت میں ایک پگھلا دیں۔
- 70% ایتھنول کے ساتھ ایمپول یا شیشی کے باہر کو جلدی سے صاف کریں۔ اگر خلیے شیشے کے ایمپول میں ہیں تو، انگلیوں کو ٹوٹے ہوئے شیشے سے بچانے کے لیے اس بات کو یقینی بناتے ہوئے ایمپول کو احتیاط سے توڑ دیں۔
- 1 ملی لیٹر منجمد خلیوں کو جراثیم سے پاک پائپیٹ سے ہٹائیں اور 10 ملی لیٹر میڈیم کے ساتھ T-25 فلاسک میں رکھیں۔ واضح طور پر ہر سیل لائن کی شناخت کے لیے فلاسک کو لیبل کریں۔
- فلاسک کو 5% CO کے ساتھ 37°C کے نمی والے انکیوبیٹر میں رکھیں۔2 ہوا میں فلاسکس کو سیدھی پوزیشن میں لگانا چاہیے۔
- 24 گھنٹے کے بعد، فلاسک کے نچلے حصے میں موجود لیمفوسائٹس کو پریشان کیے بغیر اوپر سے 5 ملی لیٹر میڈیم کو ہٹا دیں اور 5 ملی لیٹر پہلے سے گرم میڈیم سے تبدیل کریں۔
- لیمفوبلاسٹ سیل کلچر پروٹوکول کے ساتھ آگے بڑھیں۔
لمفوبلاسٹ کلچر
-
- پگھلنے کے تین سے چار دن بعد، خلیات شمار کریں۔ خلیے غیر ماننے والے ہوتے ہیں اور گچھوں میں بڑھتے ہیں۔ ہلکی پائپٹنگ کے ذریعے کلپس کو توڑ دیں۔
- خلیوں کی گنتی کریں۔
- مثالی طور پر، سیل کی حراستی 2 x 10 سے زیادہ نہیں ہونی چاہیے۔6 خلیات/ملی۔
- سیل ارتکاز پر منحصر ہے refeed، تقسیم یا منجمد خلیات.
- متوازن گروتھ میڈیم میں 5-6 ملی لیٹر شامل کرکے ریفڈ کریں۔
- نئی ثقافتوں کو 2 x 10 سے کم پر بیج دیں۔5 خلیات/ملی۔
- سیلز کو تقریباً 5 x 10 پر منجمد کیا جانا چاہیے۔6 خلیات/ملی۔ سیل فریزنگ پروٹوکول پر عمل کریں۔
منجمد لیمفوبلاسٹس
-
- سیلز کو تقریباً 5 x 10 پر منجمد کیا جانا چاہیے۔6 خلیات/ملی۔
- خلیات کے مناسب حجم کو 15 یا 50 ملی لیٹر مخروطی ٹیوب میں منتقل کریں۔
- 10 منٹ کے لیے 100 xg پر 4°C پر سینٹرفیوج کریں۔
- درمیانے درجے کو ہٹا دیں اور کولڈ فریزنگ میڈیم کے مناسب حجم میں دوبارہ معطل کریں۔
- ہر ایک کو 1 ملی لیٹر خلیات کریووئل میں منتقل کریں۔
- فریزنگ چیمبر میں cryovials رکھیں اور چیمبر کو -80 ° C فریزر میں رات بھر رکھیں۔
- کریوویئلز کو اگلے دن مائع نائٹروجن میں منتقل کریں۔
مزید معلومات کے لیے برائے مہربانی رابطہ کریں:
لیسلی بی گورڈن، ایم ڈی، پی ایچ ڈی
براؤن یونیورسٹی کے پیڈیاٹرکس ریسرچ وارن الپرٹ میڈیکل سکول کے پروفیسر اور شعبہ اطفال، ہاسبرو چلڈرن ہسپتال، پروویڈنس، RI ڈیپارٹمنٹ آف اینستھیزیا، چلڈرن ہسپتال بوسٹن اور ہارورڈ میڈیکل سکول، بوسٹن، ایم اے میڈیکل ڈائریکٹر، دی پروجیریا ریسرچ فاؤنڈیشن۔
فون: 978-535-2594
فیکس: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
وینڈی نورس
فون: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org