Выбор страницы

Лимфобласт Клетка

Протоколы культуры

 

Протокол для культивирования трансформированных лимфоцитов

От отгрузки замороженных клеток

Замороженные клетки будут получены в аликвотах 1 мл на сухом льду. Храните клетки замороженными до оттаивания для культивирования клеток или помещайте в хранилище с жидким азотом, если сразу не запускаете культуры. Однако, если вы собираетесь хранить клетки для дальнейшего использования, рекомендуется вырастить свежие запасы и заморозить несколько ампул. Клетки криоконсервированы в 45% RPMI-1640, 50% эмбриональная сыворотка теленка и 5% DMSO (уровень культуры ткани).

  1. Поместите 10 мл RPMI-1640, 15% фетальной сыворотки теленка (FCS), ± антибиотики в колбу T-25.
  2. Разрешить СМИ для уравновешивания в увлажненном инкубаторе 37 ° C с воздухом 5% CO 2in в течение минут 30.
  3. Размораживайте каждую ампулу замороженных клеток на водяной бане 37 ° C или в стакане с теплой водой, по одной за раз.
  4. Быстро очистите внешнюю сторону ампулы стерильной изопропанольной подготовительной прокладкой, затем оберните подготовительную прокладку вокруг ампулы, чтобы защитить пальцы и треснуть уплотнение на ампуле внутри биологического защитного колпачка.
  5. Удалите 1 мл замороженных клеток стерильной стеклянной пипеткой Пастера и поместите в колбу T-25 с 10 мл среды. Четко маркируйте колбу для идентификации каждой клеточной линии.
  6. Поместите клетки в увлажненный инкубатор 37 ° C с 5% CO 2 в воздухе.
  7. После часов 24 удалите 5 мл среды сверху, не нарушая лимфоциты, осевшие на дне колбы, и замените 5 мл предварительно нагретой среды.
  8. Подкармливайте клетки 5-6 мл свежей среды каждые 3-4 дня и при необходимости разделяйте на новые культуры.

От отгрузки живых культур

  1. Культуры живых лимфоцитов будут получены в колбах T-25, заполненных сверху RPMI-1640, 15% FCS, 1% пенициллин-стрептомицин (Gibco). Крышки будут плотно закрыты парафином.
  2. Удалить парафильм.
  3. Поместите культуры в увлажненный инкубатор при 37 ° C с 5% CO2 в воздухе и дайте клеткам отстояться (20-30 минут).
  4. С помощью стерильной пипетки удалите все, кроме 10–15 мл среды, и выбросьте.
  5. Установите колпачки обратно на колбы, слегка ослабленные для обеспечения газообмена (убедитесь, что на резьбах колпачков нет носителя. Если это так, возможно, вы захотите перенести их в новую колбу.) Поместите культуры обратно в инкубатор с 5% CO 2in. воздух. Они должны выздороветь через день или два.
  6. Подавайте клетки свежей средой каждые 3-4 дня, ресуспендируя клеточные агрегаты, удаляя 50-60% объема и заменяя свежей средой. Клетки, извлеченные из колбы, можно использовать для инициации новых культур по мере необходимости.

Для получения дополнительной информации, пожалуйста, свяжитесь с:

Лесли Б. Гордон, доктор медицинских наук, доктор философии

Профессор педиатрических исследований Медицинская школа Уоррена Альперта Университета Брауна и кафедра педиатрии Детской больницы Хасбро, Провиденс, отделение анестезии Род-Айленда, Детская больница Бостона и Гарвардская медицинская школа, Бостон, магистр медицины, медицинский директор, Исследовательский фонд Прогерии

Телефон: 978-535-2594
Факс: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

Венди Норрис
PRF Cell and Tissue Bank
Телефон: 401-274-1122 х 48063
wnorris@lifespan.org