Лимфобласт Клетка
Протоколы культуры
Протокол для культивирования трансформированных лимфоцитов
От отгрузки замороженных клеток
Замороженные клетки будут получены в аликвотах 1 мл на сухом льду. Храните клетки замороженными до оттаивания для культивирования клеток или помещайте в хранилище с жидким азотом, если сразу не запускаете культуры. Однако, если вы собираетесь хранить клетки для дальнейшего использования, рекомендуется вырастить свежие запасы и заморозить несколько ампул. Клетки криоконсервированы в 45% RPMI-1640, 50% эмбриональная сыворотка теленка и 5% DMSO (уровень культуры ткани).
- Поместите 10 мл RPMI-1640, 15% фетальной сыворотки теленка (FCS), ± антибиотики в колбу T-25.
- Разрешить СМИ для уравновешивания в увлажненном инкубаторе 37 ° C с воздухом 5% CO 2in в течение минут 30.
- Размораживайте каждую ампулу замороженных клеток на водяной бане 37 ° C или в стакане с теплой водой, по одной за раз.
- Быстро очистите внешнюю сторону ампулы стерильной изопропанольной подготовительной прокладкой, затем оберните подготовительную прокладку вокруг ампулы, чтобы защитить пальцы и треснуть уплотнение на ампуле внутри биологического защитного колпачка.
- Удалите 1 мл замороженных клеток стерильной стеклянной пипеткой Пастера и поместите в колбу T-25 с 10 мл среды. Четко маркируйте колбу для идентификации каждой клеточной линии.
- Поместите клетки в увлажненный инкубатор 37 ° C с 5% CO 2 в воздухе.
- После часов 24 удалите 5 мл среды сверху, не нарушая лимфоциты, осевшие на дне колбы, и замените 5 мл предварительно нагретой среды.
- Подкармливайте клетки 5-6 мл свежей среды каждые 3-4 дня и при необходимости разделяйте на новые культуры.
От отгрузки живых культур
- Культуры живых лимфоцитов будут получены в колбах T-25, заполненных сверху RPMI-1640, 15% FCS, 1% пенициллин-стрептомицин (Gibco). Крышки будут плотно закрыты парафином.
- Удалить парафильм.
- Поместите культуры в увлажненный инкубатор при 37 ° C с 5% CO2 в воздухе и дайте клеткам отстояться (20-30 минут).
- С помощью стерильной пипетки удалите все, кроме 10–15 мл среды, и выбросьте.
- Установите колпачки обратно на колбы, слегка ослабленные для обеспечения газообмена (убедитесь, что на резьбах колпачков нет носителя. Если это так, возможно, вы захотите перенести их в новую колбу.) Поместите культуры обратно в инкубатор с 5% CO 2in. воздух. Они должны выздороветь через день или два.
- Подавайте клетки свежей средой каждые 3-4 дня, ресуспендируя клеточные агрегаты, удаляя 50-60% объема и заменяя свежей средой. Клетки, извлеченные из колбы, можно использовать для инициации новых культур по мере необходимости.
Для получения дополнительной информации, пожалуйста, свяжитесь с:
Лесли Б. Гордон, доктор медицинских наук, доктор философии
Профессор педиатрических исследований Медицинская школа Уоррена Альперта Университета Брауна и кафедра педиатрии Детской больницы Хасбро, Провиденс, отделение анестезии Род-Айленда, Детская больница Бостона и Гарвардская медицинская школа, Бостон, магистр медицины, медицинский директор, Исследовательский фонд Прогерии
Телефон: 978-535-2594
Факс: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
Венди Норрис
Телефон: 401-274-1122 х 48063
wnorris@lifespan.org