लिम्फोब्लास्ट्सच्या संवर्धनासाठी प्रोटोकॉल

वाढीचे मध्यम

RPMI 1640 – थर्मोफिशर # 11875
१५१TP३टी फेटल बोवाइन सीरम (एफबीएस) – थर्मोफिशर १TP५टी१०४३७-०२८
११TP३टी (१एक्स) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमायसिन (पर्यायी) – थर्मोफिशर १TP५टी१५१४०-१२२

सामान्य नोट्स

• इनक्यूबेटरमध्ये वाढीचे माध्यम नेहमी ३७°C, ५१TP3T CO वर संतुलित ठेवावे.₂ वापरण्यापूर्वी 30 मिनिटे
• नेहमी हवेशीर कॅप्स असलेले फ्लास्क वापरा.
• फ्लास्क नेहमी सरळ स्थितीत ठेवा.
• T25 फ्लास्कमध्ये 20 मिली पेक्षा जास्त वापरू नये.

गोठलेल्या पेशी वितळवणे

गोठवलेल्या पेशी कोरड्या बर्फावर १ मिली अलिकोटमध्ये मिळतील. पेशी कल्चरसाठी पेशी वितळत नाहीत तोपर्यंत गोठवून ठेवा किंवा लगेच कल्चर सुरू करत नसल्यास द्रव नायट्रोजन स्टोरेजमध्ये ठेवा. तथापि, जर तुम्ही नंतर वापरण्यासाठी पेशी साठवणार असाल तर ताजे साठे वाढवा आणि अनेक अँप्युल्स गोठवा अशी शिफारस केली जाते. पेशी ४५१TP३T RPMI-१६४०, ५०१TP३T FBS आणि ५१TP३T DMSO (टिशू कल्चर ग्रेड) मध्ये क्रायोप्रिझर्व केल्या जातात.

1. 1. १० मिली RPMI-१६४०, १५१TP३T फेटल बोवाइन सीरम (FBS), ± अँटीबायोटिक्स एका T-२५ फ्लास्कमध्ये ठेवा ज्यामध्ये व्हेंटेड कॅप आहे.
   2. ५१TP3T CO असलेल्या ३७°C आर्द्रता असलेल्या इनक्यूबेटरमध्ये माध्यमांना समतोल साधू द्या.₂ ३० मिनिटे हवेत ठेवा. फ्लास्क सरळ स्थितीत उबवावेत.
   3. गोठलेल्या पेशींचे प्रत्येक अँप्युल किंवा कुपी ३७°C च्या वॉटर बाथमध्ये किंवा कोमट पाण्याच्या बीकरमध्ये एका वेळी एक वितळवा.
   4. ७०१TP३टी इथेनॉलने एम्प्यूल किंवा कुपीच्या बाहेरील बाजू लवकर स्वच्छ करा. जर पेशी काचेच्या एम्प्यूलमध्ये असतील तर एम्प्यूल काळजीपूर्वक फोडा जेणेकरून बोटांचे काचेच्या तुटण्यापासून संरक्षण होईल.
   5. १ मिली गोठलेल्या पेशी एका निर्जंतुकीकरण पाईपेटने काढा आणि १० मिली माध्यम असलेल्या T-25 फ्लास्कमध्ये ठेवा. प्रत्येक पेशी रेषा ओळखण्यासाठी फ्लास्कवर स्पष्टपणे लेबल लावा.
   6. फ्लास्क 5% CO असलेल्या 37°C आर्द्रता असलेल्या इनक्यूबेटरमध्ये ठेवा.₂ हवेत. फ्लास्क सरळ स्थितीत उबवावेत.
   7. २४ तासांनंतर, फ्लास्कच्या तळाशी बसलेल्या लिम्फोसाइट्सना त्रास न देता वरून ५ मिली माध्यम काढा आणि त्याऐवजी ५ मिली पूर्व-गरम केलेले माध्यम लावा.
   8. लिम्फोब्लास्ट सेल कल्चर प्रोटोकॉलसह पुढे जा.

लिम्फोब्लास्ट कल्चर

1. 1. वितळल्यानंतर तीन ते चार दिवसांनी, पेशी मोजा. पेशी चिकटत नाहीत आणि गुठळ्यांमध्ये वाढतात. हलक्या पाईपिंगने गुठळ्या तोडून टाका.
   2. पेशी मोजा.
   3. आदर्शपणे, पेशींची एकाग्रता २ x १० पेक्षा जास्त नसावी⁶ पेशी/मिली.
   4. पेशींच्या एकाग्रतेनुसार, पेशींना पुन्हा खायला द्या, विभाजित करा किंवा गोठवा.
   5. ५-६ मिली संतुलित वाढीचे माध्यम घालून पुन्हा खत घाला.
   6. कमीत कमी २ x १० या प्रमाणात नवीन कल्चर्स पेरा.⁵ पेशी/मिली.
   7. पेशी अंदाजे ५ x १० वर गोठवल्या पाहिजेत.⁶ पेशी/मिली. सेल फ्रीझिंग प्रोटोकॉलचे अनुसरण करा.

गोठवणारे लिम्फोब्लास्ट्स

1. 1. पेशी अंदाजे ५ x १० वर गोठवल्या पाहिजेत.⁶ पेशी/मिली.
   2. योग्य आकारमानाच्या पेशी १५ किंवा ५० मिली शंकूच्या आकाराच्या नळीत हलवा.
   3. ४°C वर १०० xg वर १० मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज.
   4. माध्यम काढा आणि योग्य प्रमाणात थंड गोठवणाऱ्या माध्यमात पुन्हा सामावून घ्या.
   5. प्रत्येकी १ मिली पेशी क्रायोव्हियलमध्ये स्थानांतरित करा.
   6. क्रायओव्हियल फ्रीझिंग चेंबरमध्ये ठेवा आणि चेंबर रात्रभर -८०°C फ्रीजरमध्ये ठेवा.
   7. दुसऱ्या दिवशी क्रायोव्हियल द्रव नायट्रोजनमध्ये स्थानांतरित करा.

वेंडी नॉरिस