Do embarque de células congeladas

As células congeladas serão recebidas em alíquotas de 1 ml em gelo seco. Mantenha as células congeladas até descongelar para a cultura celular ou coloque-as no armazenamento de nitrogênio líquido, se não iniciar as culturas imediatamente. No entanto, é recomendável que, se você pretende armazenar as células para uso posterior, cresça em estoque fresco e congele várias ampolas. As células são criopreservadas em 45% RPMI-1640, soro fetal de vitelo 50% e DUMO 5% (grau de cultura de tecidos).

1. Coloque 10 ml de RPMI-1640, soro fetal de vitelo 15% (FCS), ± antibióticos em um balão T-25.
2. Permita que a mídia se equilibre em uma incubadora umidificada 37 ° C com ar 5% CO 2in por minutos 30.
3. Descongele cada ampola de células congeladas em um banho de água 37 ° C ou em um copo de água morna, uma de cada vez.
4. Limpe rapidamente a parte externa da ampola com uma compressa estéril de isopropanol e, em seguida, enrole a compressa ao redor da ampola para proteger os dedos e quebre a vedação da ampola dentro de um capuz de segurança biológica.
5. Remova o 1 ml de células congeladas com uma pipeta Pasteur de vidro estéril e coloque em um balão T-25 com 10 ml de meio. Identifique claramente o balão para identificar cada linha celular.
6. Coloque as células em uma incubadora umidificada 37 ° C com 5% CO 2 no ar.
7. Após as horas 24, remova o 5 ml de meio da parte superior sem perturbar os linfócitos depositados no fundo do balão e substitua-o por 5 ml de meio pré-aquecido.
8. Alimente as células com 5 - 6 ml de meio fresco a cada 3 - 4 dias e divida em novas culturas conforme necessário.

Do envio de culturas vivas

1. As culturas de linfócitos vivos serão recebidas em frascos T-25 preenchidos com RPMI-1640, 15% FCS, 1% Penicilina-Estreptomicina (Gibco). As tampas serão apertadas e seladas com parafilme.
2. Remova o parafilme.
3. Colocar as culturas em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO2 no ar e permitir que as células assentem (20 - 30 minutos).
4. Usando uma pipeta estéril, remova tudo, exceto 10 - 15 ml de meio e descarte.
5. Coloque as tampas novamente nos frascos, levemente um pouco frouxas para permitir a troca de gases (verifique se as roscas das tampas não possuem mídia. Se desejar, transfira para um novo frasco.) Coloque as culturas de volta na incubadora com 5% CO 2in ar. Eles devem se recuperar em um dia ou dois.
6. Alimente as células com meio fresco a cada 3 - 4 dias ressuspendendo os agregados celulares e removendo 50 -60% do volume e substituindo por meio fresco. As células removidas do frasco podem ser usadas para iniciar novas culturas conforme necessário.

Wendy Norris