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Lymphoblast Cell

Kulturprotokolle

 

Protokoll zur Kultivierung transformierter Lymphozyten

Aus dem Versand von Tiefkühlzellen

Gefrorene Zellen werden in 1 ml-Aliquots auf Trockeneis erhalten. Halten Sie die Zellen bis zum Auftauen für die Zellkultur gefroren oder lagern Sie sie in flüssigem Stickstoff, wenn Sie die Kulturen nicht sofort starten. Es wird jedoch empfohlen, dass Sie, wenn Sie die Zellen für die spätere Verwendung aufbewahren, frische Vorräte anbauen und mehrere Ampullen einfrieren. Die Zellen sind in 45% RPMI-1640, 50% fötalem Kälberserum und 5% DMSO (Gewebekulturqualität) kryokonserviert.

  1. Geben Sie 10 ml RPMI-1640, 15% fötales Kälberserum (FCS), ± Antibiotika in einen T-25-Kolben.
  2. Lassen Sie das Medium in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2in Luft für 30 Minuten äquilibrieren.
  3. Tauen Sie jede Ampulle mit gefrorenen Zellen nacheinander in einem Wasserbad mit 37 ° C oder einem Becher mit lauwarmem Wasser auf.
  4. Reinigen Sie die Außenseite der Ampulle schnell mit einem sterilen Isopropanol-Prep-Pad und wickeln Sie das Prep-Pad dann um die Ampulle, um die Finger zu schützen und das Siegel der Ampulle in einer biologischen Schutzhaube zu öffnen.
  5. Entfernen Sie die 1 ml gefrorener Zellen mit einer Pasteurpipette aus sterilem Glas und geben Sie sie mit 25 ml Medium in einen T-10-Kolben. Etikettieren Sie den Kolben eindeutig, um jede Zelllinie zu identifizieren.
  6. Platzieren Sie die Zellen in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 in der Luft.
  7. Nach 24 Stunden 5 ml Medium von der Oberseite entfernen, ohne die am Boden des Kolbens abgelagerten Lymphozyten zu stören, und durch 5 ml vorgewärmtes Medium ersetzen.
  8. Füttere die Zellen alle 5 - 6 Tage mit 3 - 4 ml frischem Medium und teile sie nach Bedarf in neue Kulturen auf.

Aus dem Versand lebender Kulturen

  1. Lebende Lymphozytenkulturen werden in T-25-Kolben, die bis zum oberen Rand mit RPMI-1640, 15% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin (Gibco) gefüllt sind, erhalten. Die Kappen sind fest und mit Parafilm verschlossen.
  2. Parafilm entfernen.
  3. Legen Sie die Kulturen in einen befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO2 in Luft und lassen Sie die Zellen sich absetzen (20 - 30 Minuten).
  4. Entfernen Sie mit einer sterilen Pipette alle bis auf 10 - 15 ml Medium und entsorgen Sie sie.
  5. Setzen Sie die Kappen wieder auf die Kolben, die leicht gelöst sind, um den Gasaustausch zu ermöglichen. (Stellen Sie sicher, dass die Kappengewinde keine Medien enthalten. Wenn dies der Fall ist, können Sie sie in einen neuen Kolben umfüllen.) Geben Sie die Kulturen mit 5% CO 2in in den Inkubator zurück Luft. Sie sollten sich in ein oder zwei Tagen erholen.
  6. Füttern Sie die Zellen alle 3 bis 4 Tage mit frischem Medium, indem Sie die Zellaggregate resuspendieren, 50 bis 60% des Volumens entfernen und durch frisches Medium ersetzen. Aus dem Kolben entfernte Zellen können verwendet werden, um nach Bedarf neue Kulturen zu initiieren.

Für weitere Informationen kontaktieren Sie bitte:

Leslie B. Gordon, MD, PhD

Professor für Pädiatrieforschung Warren Alpert Medical School der Brown University und Abteilung für Pädiatrie, Hasbro Kinderkrankenhaus, Providence, RI Abteilung für Anästhesie, Kinderkrankenhaus Boston und Harvard Medical School, Boston, MA Ärztlicher Direktor, The Progeria Research Foundation

Telefon: 978-535-2594
Fax: 508-543-0377
Leslie_Gordon@brown.edu

Wendy Norris
PRF Cell and Tissue Bank
Telefon: 401-274-1122 x 48063
wnorris@lifespan.org