Protokoll zur Kultivierung von Lymphoblasten

Wachstumsmedium

RPMI 1640 – ThermoFisher # 11875
15% Fetales Rinderserum (FBS) – ThermoFisher #10437-028
1% (1X) Penicillin-Streptomycin (optional) – ThermoFisher #15140-122

Allgemeine Hinweise

• Das Wachstumsmedium sollte im Inkubator immer auf 37°C, 5% CO₂ 30 Minuten vor Gebrauch
• Benutzen Sie immer Flaschen mit belüfteten Verschlüssen
• Bebrüten Sie den Kolben immer in aufrechter Position
• Es sollten nicht mehr als 20 ml in einem T25-Kolben verwendet werden

Auftauen gefrorener Zellen

Gefrorene Zellen werden in 1-ml-Aliquots auf Trockeneis geliefert. Bewahren Sie die Zellen gefroren auf, bis sie für die Zellkultur aufgetaut werden, oder legen Sie sie in flüssigen Stickstoff, wenn Sie nicht sofort mit der Kultur beginnen. Es wird jedoch empfohlen, dass Sie, wenn Sie die Zellen für eine spätere Verwendung aufbewahren möchten, frische Vorräte anbauen und mehrere Ampullen einfrieren. Die Zellen werden in 45% RPMI-1640, 50% FBS und 5% DMSO (Gewebekulturqualität) kryokonserviert.

1. 1. Geben Sie 10 ml RPMI-1640, 15% fötales Rinderserum (FBS), ± Antibiotika in eine T-25-Flasche mit belüfteter Kappe.
   2. Lassen Sie das Medium in einem 37 °C befeuchteten Inkubator mit 5% CO ausgleichen₂ 30 Minuten an der Luft inkubieren. Die Flaschen sollten aufrecht inkubiert werden.
   3. Tauen Sie jede Ampulle oder jedes Fläschchen mit gefrorenen Zellen einzeln in einem 37 °C warmen Wasserbad oder einem Becher mit lauwarmem Wasser auf.
   4. Reinigen Sie die Außenseite der Ampulle oder des Fläschchens schnell mit 70% Ethanol. Wenn sich die Zellen in einer Glasampulle befinden, zerbrechen Sie die Ampulle vorsichtig und schützen Sie dabei Ihre Finger vor Glassplittern.
   5. Entnehmen Sie den 1 ml gefrorener Zellen mit einer sterilen Pipette und geben Sie ihn in eine T-25-Flasche mit 10 ml Medium. Beschriften Sie die Flasche deutlich, um jede Zelllinie zu identifizieren.
   6. Stellen Sie den Kolben in einen 37°C befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂ in der Luft. Flaschen sollten in aufrechter Position inkubiert werden.
   7. Nach 24 Stunden 5 ml Medium von oben entfernen, ohne die am Boden des Kolbens abgelagerten Lymphozyten zu stören, und durch 5 ml vorgewärmtes Medium ersetzen.
   8. Fahren Sie mit dem Protokoll zur Lymphoblastenzellkultur fort.

Lymphoblastenkultur

1. 1. Drei bis vier Tage nach dem Auftauen die Zellen zählen. Die Zellen sind nicht haftend und wachsen in Klumpen. Klumpen durch vorsichtiges Pipettieren aufbrechen.
   2. Zellen zählen.
   3. Idealerweise sollte die Zellkonzentration 2 x 10 nicht überschreiten⁶ Zellen/ml.
   4. Je nach Zellkonzentration können die Zellen erneut zugeführt, geteilt oder eingefroren werden.
   5. Führen Sie die Fütterung durch Zugabe von 5–6 ml ausgeglichenem Wachstumsmedium durch.
   6. Säen Sie neue Kulturen mit mindestens 2 x 10⁵ Zellen/ml.
   7. Die Zellen sollten bei etwa 5 x 10 eingefroren werden⁶ Zellen/ml. Befolgen Sie das Protokoll zum Einfrieren von Zellen.

Einfrieren von Lymphoblasten

1. 1. Die Zellen sollten bei etwa 5 x 10 eingefroren werden⁶ Zellen/ml.
   2. Übertragen Sie das entsprechende Zellvolumen in ein 15- oder 50-ml-konisches Röhrchen.
   3. 10 Minuten lang bei 4 °C und 100 xg zentrifugieren.
   4. Entfernen Sie das Medium und suspendieren Sie es im entsprechenden Volumen kalten Gefriermediums erneut.
   5. Übertragen Sie jeweils 1 ml Zellen in ein Kryovial.
   6. Legen Sie die Kryoröhrchen in die Gefrierkammer und stellen Sie die Kammer über Nacht in einen -80 °C heißen Gefrierschrank.
   7. Überführen Sie die Kryoröhrchen am nächsten Tag in flüssigen Stickstoff.

Wendy Norris