À partir de l'envoi de cellules congelées

Les cellules congelées seront reçues dans des aliquotes de 1 ml sur de la neige carbonique. Gardez les cellules congelées jusqu'à décongélation pour la culture cellulaire ou placez-les dans un stockage d'azote liquide si vous ne commencez pas les cultures immédiatement. Cependant, il est recommandé, si vous prévoyez de stocker les cellules pour une utilisation ultérieure, de constituer de nouveaux stocks et de congeler plusieurs ampoules. Les cellules sont cryoconservées dans 45% RPMI-1640, 50% sérum de veau foetal et 5% DMSO (qualité de culture tissulaire).

1. Placer 10 ml de RPMI-1640, 15% sérum de veau foetal (FCS), ± antibiotiques dans un ballon T-25.
2. Laisser le support s'équilibrer dans un incubateur humidifié 37 ° C avec 5% CO 2in air pendant quelques minutes 30.
3. Décongeler chaque ampoule de cellules congelées dans un bain-marie 37 ° C ou un bécher d’eau tiède, l’une après l’autre.
4. Nettoyez rapidement l'extérieur de l'ampoule avec un tampon de préparation stérile en isopropanol, puis enroulez le tampon de préparation autour de l'ampoule pour protéger les doigts et fissurez le sceau de l'ampoule à l'intérieur d'un capuchon de protection biologique.
5. Retirer 1 ml de cellules congelées avec une pipette Pasteur en verre stérile et les placer dans un flacon T-25 avec 10 ml de milieu. Étiquetez clairement le flacon pour identifier chaque lignée cellulaire.
6. Placez les cellules dans un incubateur humidifié 37 ° C avec 5% CO 2 dans l'air.
7. Après 24 heures, retirez 5 ml de milieu par le haut sans gêner les lymphocytes fixés au fond du ballon et remplacez-les par 5 ml de milieu préchauffé.
8. Nourrissez les cellules avec 5 à 6 ml de milieu frais tous les 3 à 4 jours et divisez-les en nouvelles cultures si nécessaire.

De l'expédition des cultures vivantes

1. Les cultures de lymphocytes vivants seront reçues dans des flacons T-25 remplis au maximum de RPMI-1640, 15% FCS, 1% pénicilline-streptomycine (Gibco). Les bouchons seront serrés et scellés avec du parafilm.
2. Retirez le parafilm.
3. Placer les cultures dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec 5% de CO2 dans l'air et laisser les cellules se déposer (20 à 30 minutes).
4. À l'aide d'une pipette stérile, retirer tout sauf 10 à 15 ml de milieu et le jeter.
5. Remettez les bouchons sur les flacons légèrement desserrés pour permettre l'échange de gaz (vérifiez que les filets des bouchons ne contiennent pas de support. Si vous souhaitez transférer dans un nouveau flacon.) Remettez les cultures dans l'incubateur avec 5% CO 2in. air. Ils devraient récupérer dans un jour ou deux.
6. Nourrissez les cellules avec un milieu frais tous les 3 à 4 jours en remettant en suspension les agrégats cellulaires et en retirant 50 à 60% du volume et en les remplaçant par des médias frais. Les cellules retirées du flacon peuvent être utilisées pour lancer de nouvelles cultures si nécessaire.

Wendy Norris