림프모세포 배양 프로토콜

성장 매체

RPMI 1640 – ThermoFisher # 11875
15% 태아우혈청(FBS) – ThermoFisher #10437-028
1%(1X) 페니실린-스트렙토마이신(선택 사항) – ThermoFisher #15140-122

일반 참고 사항

• 성장 매체는 항상 37°C, 5% CO의 인큐베이터에서 평형을 유지해야 합니다.₂ 사용 전 30분 동안
• 항상 통풍구가 있는 캡이 있는 플라스크를 사용하세요
• 항상 플라스크를 수직으로 세워서 배양하십시오.
• T25 플라스크에는 20ml 이상을 사용해서는 안 됩니다.

냉동 세포 해동

동결된 세포는 건조 얼음 위에 1ml 분량으로 제공됩니다. 세포 배양을 위해 해동할 때까지 세포를 동결 상태로 유지하거나, 바로 배양을 시작하지 않을 경우 액체 질소 보관소에 보관합니다. 그러나 나중에 사용하기 위해 세포를 보관하려는 경우 신선한 스톡을 배양하고 여러 앰플을 동결하는 것이 좋습니다. 세포는 45% RPMI-1640, 50% FBS 및 5% DMSO(조직 배양 등급)에서 냉동 보관합니다.

1. 1. 통풍구가 있는 캡이 달린 T-25 플라스크에 RPMI-1640, 15% 태아우시혈청(FBS), ± 항생제 10ml를 넣습니다.
   2. 5% CO가 포함된 37°C 습도 인큐베이터에서 배지가 평형을 이루도록 합니다.₂ 공기 중에서 30분 동안. 플라스크는 수직으로 배양해야 합니다.
   3. 냉동된 세포의 앰플이나 바이알을 한 번에 하나씩 37°C 수조나 미지근한 물이 담긴 비이커에 넣어 해동합니다.
   4. 70% 에탄올로 앰플이나 바이알의 외부를 빠르게 닦습니다. 세포가 유리 앰플에 들어 있는 경우, 손가락이 깨진 유리로부터 보호되도록 주의하면서 앰플을 조심스럽게 깨십시오.
   5. 멸균 피펫으로 동결된 세포 1ml를 꺼내고 10ml의 배지가 있는 T-25 플라스크에 넣습니다. 각 세포주를 식별하기 위해 플라스크에 명확하게 라벨을 붙입니다.
   6. 플라스크를 5% CO가 들어 있는 37°C 가습 인큐베이터에 넣으세요.₂ 공기 중에서. 플라스크는 수직으로 배양해야 합니다.
   7. 24시간 후, 플라스크 바닥에 가라앉은 림프구를 건드리지 않고 위쪽에서 배지 5ml를 제거하고, 미리 데워둔 배지 5ml로 교체합니다.
   8. 림프모세포 배양 프로토콜을 진행하세요.

림프모세포 배양

1. 1. 해동 후 3~4일 후에 세포를 세십시오. 세포는 부착되지 않고 덩어리로 자랍니다. 부드럽게 피펫팅하여 덩어리를 분해하십시오.
   2. 세포를 세어보세요.
   3. 이상적으로 세포 농도는 2 x 10을 초과해서는 안 됩니다.⁶ 세포/ml.
   4. 세포 농도에 따라 세포를 재공급, 분할 또는 동결합니다.
   5. 평형화된 성장배지 5~6ml를 추가하여 다시 공급합니다.
   6. 최소 2 x 10의 새로운 문화권을 심으세요⁵ 세포/ml.
   7. 세포는 약 5 x 10에서 동결되어야 합니다.⁶ 세포/ml. 세포 동결 프로토콜을 따르세요.

동결 림프모세포

1. 1. 세포는 약 5 x 10에서 동결되어야 합니다.⁶ 세포/ml.
   2. 적정량의 세포를 15 또는 50ml 원뿔형 튜브에 옮깁니다.
   3. 4°C에서 100 xg로 10분간 원심분리합니다.
   4. 배지를 제거한 후 적절한 양의 차가운 냉동 배지에 다시 현탁시킵니다.
   5. 각 세포 1ml를 크라이오바이알에 옮깁니다.
   6. 냉동실에 크라이오바이알을 넣고 -80°C 냉동고에 밤새 넣어둡니다.
   7. 다음 날, 크라이오바이알을 액체질소로 옮깁니다.

웬디 노리스