লিম্ফোব্লাস্ট কোষ
সংস্কৃতি প্রোটোকল
রূপান্তরিত লিম্ফোসাইট সংস্কৃতির জন্য প্রোটোকল
লিম্ফোব্লাস্ট কালচারিংয়ের প্রোটোকল
বৃদ্ধির মাধ্যম
RPMI 1640 – থার্মোফিশার # 11875
১৫১টিপি৩টি ফেটাল বোভাইন সিরাম (এফবিএস) – থার্মোফিশার ১টিপি৫টি১০৪৩৭-০২৮
১১টিপি৩টি (১এক্স) পেনিসিলিন-স্ট্রেপ্টোমাইসিন (ঐচ্ছিক) – থার্মোফিশার ১টিপি৫টি১৫১৪০-১২২
সাধারণ নোট
- ইনকিউবেটরে বৃদ্ধির মাধ্যম সর্বদা ৩৭°C, ৫১TP3T CO তাপমাত্রায় ভারসাম্যপূর্ণ রাখতে হবে।2 ব্যবহারের ৩০ মিনিট আগে
- সর্বদা বাতাস চলাচলের জন্য ঢাকনাযুক্ত ফ্লাস্ক ব্যবহার করুন।
- ফ্লাস্কটি সর্বদা খাড়া অবস্থায় রাখুন।
- একটি T25 ফ্লাস্কে 20 মিলির বেশি ব্যবহার করা উচিত নয়।
হিমায়িত কোষ গলানো
হিমায়িত কোষগুলি শুষ্ক বরফে ১ মিলি অ্যালিকোটে গ্রহণ করা হবে। কোষ কালচারের জন্য কোষগুলিকে গলানো পর্যন্ত হিমায়িত রাখুন অথবা যদি এখনই কালচার শুরু না করেন তবে তরল নাইট্রোজেন স্টোরেজে রাখুন। তবে, যদি আপনি পরবর্তীতে ব্যবহারের জন্য কোষগুলি সংরক্ষণ করতে চান, তাহলে তাজা স্টক তৈরি করুন এবং একাধিক অ্যাম্পুল হিমায়িত করুন। কোষগুলি 45% RPMI-1640, 50% FBS এবং 5% DMSO (টিস্যু কালচার গ্রেড) এ ক্রিওপ্রিজারভ করা হয়।
-
- একটি T-25 ফ্লাস্কে একটি বায়ুচলাচল ক্যাপ সহ 10 মিলি RPMI-1640, 15% ভ্রূণ বোভাইন সিরাম (FBS), ± অ্যান্টিবায়োটিক রাখুন।
- 5% CO দিয়ে 37°C আর্দ্রতাযুক্ত ইনকিউবেটরে মিডিয়াকে ভারসাম্য বজায় রাখতে দিন।2 ৩০ মিনিটের জন্য বাতাসে রাখুন। ফ্লাস্কগুলিকে সোজা করে ইনকিউবেট করতে হবে।
- হিমায়িত কোষের প্রতিটি অ্যাম্পুল বা শিশি ৩৭ ডিগ্রি সেলসিয়াস তাপমাত্রার জল স্নানে অথবা হালকা গরম জলের একটি বিকারে, একে একে গলিয়ে নিন।
- 70% ইথানল দিয়ে অ্যাম্পুল বা শিশির বাইরের অংশ দ্রুত পরিষ্কার করুন। যদি কোষগুলি কাচের অ্যাম্পুলে থাকে, তাহলে সাবধানে অ্যাম্পুলটি ভেঙে ফেলুন যাতে আঙ্গুলগুলি ভাঙা কাচ থেকে রক্ষা পায়।
- একটি জীবাণুমুক্ত পাইপেট দিয়ে ১ মিলি হিমায়িত কোষগুলি বের করে ১০ মিলি মিডিয়াম সহ একটি T-25 ফ্লাস্কে রাখুন। প্রতিটি কোষ লাইন সনাক্ত করতে ফ্লাস্কে স্পষ্টভাবে লেবেল লাগান।
- ফ্লাস্কটি 5% CO দিয়ে 37°C আর্দ্রতাযুক্ত ইনকিউবেটারে রাখুন।2 বাতাসে। ফ্লাস্কগুলিকে সোজা করে রাখতে হবে।
- ২৪ ঘন্টা পর, ফ্লাস্কের নীচে বসতি স্থাপনকারী লিম্ফোসাইটগুলিকে বিরক্ত না করে উপর থেকে ৫ মিলি মিডিয়াম সরিয়ে ফেলুন এবং ৫ মিলি আগে থেকে গরম করা মিডিয়াম দিয়ে প্রতিস্থাপন করুন।
- লিম্ফোব্লাস্ট কোষ সংস্কৃতি প্রোটোকল নিয়ে এগিয়ে যান।
লিম্ফোব্লাস্ট কালচার
-
- গলানোর তিন থেকে চার দিন পর, কোষ গণনা করুন। কোষগুলি আঠালো থাকে না এবং থোকায় থোকায় বৃদ্ধি পায়। মৃদু পাইপেটিং করে থোকায়
- কোষ গণনা করুন।
- আদর্শভাবে, কোষের ঘনত্ব 2 x 10 এর বেশি হওয়া উচিত নয়6 কোষ/মিলি।
- কোষের ঘনত্বের উপর নির্ভর করে কোষগুলিকে পুনরায় খাওয়ান, বিভক্ত করুন বা হিমায়িত করুন।
- ৫-৬ মিলি সুষম বৃদ্ধির মাধ্যম যোগ করে পুনরায় খাওয়ান।
- কমপক্ষে ২ x ১০ হারে নতুন কালচার বীজ বপন করুন5 কোষ/মিলি।
- কোষগুলিকে প্রায় ৫ x ১০ এ হিমায়িত করা উচিত6 কোষ/মিলি। কোষ ফ্রিজিং প্রোটোকল অনুসরণ করুন।
হিমায়িত লিম্ফোব্লাস্ট
-
- কোষগুলিকে প্রায় ৫ x ১০ এ হিমায়িত করা উচিত6 কোষ/মিলি।
- ১৫ বা ৫০ মিলি শঙ্কুযুক্ত নলে উপযুক্ত আয়তনের কোষ স্থানান্তর করুন।
- ৪° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় ১০০ xg তাপমাত্রায় ১০ মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ।
- মাঝারিটি সরান এবং ঠান্ডা হিমায়িত মাধ্যমের যথাযথ পরিমাণে পুনরায় সাসপেনশন করুন।
- প্রতিটি ক্রায়োভিয়ালে 1 মিলি কোষ স্থানান্তর করুন।
- ক্রায়োভিয়ালগুলিকে ফ্রিজিং চেম্বারে রাখুন এবং রাতারাতি চেম্বারটি -80°C ফ্রিজে রাখুন।
- পরের দিন ক্রায়োভিয়ালগুলিকে তরল নাইট্রোজেনে স্থানান্তর করুন।
আরও তথ্যের জন্য অনুগ্রহ করে যোগাযোগ করুন:
লেসলি বি গর্ডন, এমডি, পিএইচডি
ব্রাউন ইউনিভার্সিটির পেডিয়াট্রিক্স রিসার্চ ওয়ারেন অ্যালপার্ট মেডিকেল স্কুল এবং পেডিয়াট্রিক্স বিভাগের অধ্যাপক, হাসব্রো চিলড্রেন হাসপাতাল, প্রভিডেন্স, অ্যানেস্থেশিয়ার RI বিভাগ, শিশু হাসপাতাল বোস্টন এবং হার্ভার্ড মেডিকেল স্কুল, বোস্টন, এমএ মেডিকেল ডিরেক্টর, প্রোজেরিয়া রিসার্চ ফাউন্ডেশন
ফোন: 978-535-2594
ফ্যাক্স: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
ওয়েন্ডি নরিস
ফোন: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org