Mencairkan garis sel PRF

1. Mencairkan sel dengan cepat dalam rendaman air 37˚C.
2. Bersihkan bagian luar vial dengan 70% etanol.
3. Transfer sel yang dicairkan ke labu T25 yang berisi 5 ml media pertumbuhan.
4. Tempatkan labu dalam inkubator 37˚C semalaman.
5. Hari berikutnya, amati di bawah mikroskop untuk memastikan sel-selnya menempel.
6. Hapus media dan gantikan dengan media pertumbuhan baru.

Subkultur garis sel PRF

1. Sel-sel harus dipecah saat konfluen.
2. Untuk membagi sel (volume yang diberikan mengasumsikan sel dalam T25):
   a) Dengan menggunakan teknik steril, keluarkan media dan bilas labu dengan 2-3 ml HBSS steril. Hapus dan buang HBSS.
   b) Tambahkan 1 ml tripsin dan inkubasi selama 2-3 menit. Sel harus diperiksa di bawah mikroskop terbalik untuk menentukan apakah mereka mulai membulat, terangkat dan mengapung. Jika sel tidak terlepas setelah 3 menit, Anda dapat menginkubasi 1-2 menit lagi.
   c) Kencangkan tutup dan ujung labu perlahan dari sisi ke sisi untuk mengeluarkan semua sel. Labu dapat diketuk sedikit di satu sisi untuk melonggarkan sel jika diperlukan.
   d) Tambahkan 4 ml media baru ke labu segera setelah sel mengapung untuk menonaktifkan tripsin. Bilas sisi bawah labu beberapa kali dengan media baru untuk membersihkan semua sel dari plastik dan masuk ke dalam larutan. Keluarkan semua cairan yang mengandung sel dan pindahkan ke kerucut 15ml (atau 50 ml jika Anda menyatukan 3 labu atau lebih).
   e) Dengan menggunakan teknik steril, keluarkan alikuot untuk menghitung pada hemositometer.
   f) Saat Anda menghitung sel, sisa larutan harus diputar dalam centrifuge klinis selama 5 menit pada 1000 rpm.
3. Setelah menghitung jumlah sel Anda, plat sel di 2.5 x 10⁵ sel per T25 memfilter labu atas.
4. Sel harus diberi makan setiap 2-3 hari dengan media pertumbuhan segar.

Pembekuan:

Sel harus dibekukan tidak kurang dari 5 x 10⁵ sel / ml / cryovial dalam media pertumbuhan yang mengandung 10% DMSO dan 30% FBS dan selanjutnya ditempatkan dalam ruang pembekuan isopropanol pada suhu -80˚C semalaman. Pindahkan ke nitrogen cair keesokan harinya.

Protokol untuk Subkultur dan Pembekuan Fibroblast