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섬유아세포

문화 프로토콜

 

섬유아세포의 계대배양 및 동결을 위한 프로토콜

성장 미디어

DMEM – ThermoFisher #11960-044(L-글루타민이 없는 고 포도당)

15% FBS 태아 소 혈청 – ThermoFisher #10437-028

1%(1X) 페니실린-스트렙토마이신 – ThermoFisher #15140-122

1%(1X) GlutaMAX – ThermoFisher #35050-061

트립신

트립신 EDTA C 0.25%(ThermoFisher #25200-056)

행크의 균형 잡힌 소금 솔루션

HBSS-(ThermoFisher #14170(1X) (-) 염화칼슘, (-) 염화마그네슘, (-) 황산마그네슘

냉동 용 DMSO

세포 배양 등급 DMSO – 시그마 #D2438

해동 PRF 세포주

  1. 세포를 37˚C 수조에서 빠르게 해동합니다.
  2. 70 % 에탄올로 바이알 외부를 닦습니다.
  3. 해동된 세포를 25ml의 성장 배지가 들어 있는 T5 플라스크로 옮깁니다.
  4. 플라스크를 37˚C 인큐베이터에 밤새 두십시오.
  5. 다음 날, 현미경으로 관찰하여 세포가 부착되었는지 확인하십시오.
  6. 미디어를 제거하고 새로운 성장 미디어로 교체하십시오.

PRF 세포주 배양

  1. 셀은 합류할 때 분할되어야 합니다.
  2. 셀을 분할하려면(주어진 볼륨은 셀이 T25에 있다고 가정함):
    a) 멸균 기법을 사용하여 배지를 제거하고 멸균 HBSS 2-3ml로 플라스크를 헹굽니다. HBSS를 제거하고 폐기하십시오.
    b) 트립신 1ml를 첨가하고 2~3분 동안 배양합니다. 세포가 반올림, 들어 올려지고 떠다니기 시작했는지 확인하기 위해 거꾸로 된 현미경으로 세포를 확인해야 합니다. 3분 후에도 세포가 분리되지 않으면 1-2분 더 배양할 수 있습니다.
    c) 캡을 조이고 플라스크를 좌우로 부드럽게 기울여 모든 세포를 제거합니다. 필요한 경우 플라스크를 가볍게 두드려 세포를 느슨하게 할 수 있습니다.
    d) 트립신을 불활성화하기 위해 세포가 부유하자마자 4ml의 새 배지를 플라스크에 추가합니다. 새 배지로 플라스크의 측면을 여러 번 헹구어 모든 세포를 플라스틱에서 용액으로 씻어냅니다. 세포를 포함하는 모든 액체를 제거하고 15ml 원추형(또는 50개 이상의 플라스크를 풀링하는 경우 3ml)으로 옮깁니다.
    e) 멸균 기술을 사용하여 혈구계산기에서 계수하기 위해 분취량을 제거합니다.
    f) 세포를 계수하는 동안 나머지 용액은 임상 원심분리기에서 5rpm으로 1000분 동안 회전시켜야 합니다.
  3. 셀 수를 계산한 후 2.5 x 10의 플레이트 셀5 T25 필터 상단 플라스크 당 세포.
  4. 세포는 신선한 성장 배지로 2-3일마다 공급되어야 합니다.

동결:

세포는 5 x 10 이상에서 동결되어야 합니다.5 10% DMSO 및 30% FBS를 포함하는 성장 배지에서 cells/ml/cryovial을 제거한 후 밤새 -80˚C에서 이소프로판올 동결 챔버에 넣었습니다. 다음날 액체 질소로 옮깁니다.

섬유아세포의 계대배양 및 동결을 위한 프로토콜

자세한 내용은 다음 연락처로 문의하십시오.

Leslie B. Gordon, MD, PhD

브라운 대학교 워렌 알퍼트 의과 대학 및 소아과, 하스브로 아동 병원, 프로비던스, RI 마취과, 보스턴 아동 병원, 하버드 의과 대학, 보스턴, 매사추세츠 주, The Progeria Research Foundation 의료 이사

전화 번호 :978-535-2594
팩스 : 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

웬디 노리스
PRF 세포 및 조직 은행
전화 : 401-274-1122은 48063을 X
wnorris@lifespan.org