Descongelar linhas de células PRF

1. Descongele as células rapidamente em um banho de água 37˚C.
2. Limpe a parte externa do frasco com etanol 70%.
3. Transfira as células descongeladas para um balão T25 contendo 5 ml de meio de crescimento.
4. Coloque o balão na incubadora 37˚C durante a noite.
5. No dia seguinte, observe ao microscópio para garantir que as células estejam conectadas.
6. Remova a mídia e substitua por uma nova mídia de crescimento.

Subcultura de linhas celulares PRF

1. As células devem ser divididas quando confluentes.
2. Para dividir células (os volumes fornecidos estão assumindo que as células estão em um T25):
   a) Usando uma técnica estéril, remova a mídia e enxágue o frasco com 2-3 ml de HBSS estéril. Remova e descarte o HBSS.
   b) Adicione 1 ml de tripsina e incube por 2-3 minutos. As células devem ser verificadas em um microscópio invertido para determinar se elas começaram a arredondar, levantar e flutuar. Se as células não se separarem após 3 minutos, você pode incubar mais 1-2 minutos.
   c) Aperte a tampa e incline suavemente o frasco de um lado para o outro para desalojar todas as células. O frasco pode ser batido levemente na lateral para soltar as células, se necessário.
   d) Adicione 4 ml do novo meio ao frasco assim que as células estiverem flutuando para inativar a tripsina. Enxágue as laterais do frasco várias vezes com a nova mídia para lavar todas as células do plástico e colocá-las na solução. Remova todas as células que contenham líquido e transfira para uma cônica de 15ml (ou 50ml se você estiver juntando 3 ou mais frascos).
   e) Com técnica estéril, retirar uma alíquota para contagem no hemocitômetro.
   f) Enquanto você está contando células, o resto da solução deve ser centrifugado na centrífuga clínica por 5 minutos a 1000 rpm.
3. Após calcular a contagem de células, ploque as células em 2.5 x 10⁵ células por balão superior do filtro T25.
4. As células devem ser alimentadas todos os dias 2-3 com meio de crescimento fresco.

Congelando:

As células devem ser congeladas a pelo menos 5 x 10⁵ células / ml / criotubo em meio de crescimento contendo 10% de DMSO e 30% de FBS e subsequentemente colocado em uma câmara de congelamento de isopropanol a -80 -C durante a noite. Transfira para o nitrogênio líquido no dia seguinte.

Protocolo para fibroblastos de subcultura e congelamento