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Célula fibroblástica

Protocolos Culturais

 

Protocolo para subcultura e congelamento de fibroblastos

Mídia de crescimento

DMEM – ThermoFisher #11960-044 (alta glicose sem L-glutamina)

15% FBS Soro Fetal Bovino – ThermoFisher #10437-028

1% (1X) Penicilina-Estreptomicina – ThermoFisher #15140-122

1% (1X) GlutaMAX – TermoFisher #35050-061

Tripsina

Tripsina EDTA C 0,25% (ThermoFisher #25200-056)

Solução salina balanceada de Hank

HBSS- (ThermoFisher #14170 (1X) (-) cloreto de cálcio, (-) cloreto de magnésio, (-) sulfato de magnésio

DMSO para Congelamento

Grau de cultura de células DMSO – Sigma #D2438

Descongelamento de linhas celulares PRF

  1. Descongele as células rapidamente em banho-maria a 37˚C.
  2. Limpe a parte externa do frasco com etanol 70%.
  3. Transfira as células descongeladas para um frasco T25 contendo 5 ml de meio de crescimento.
  4. Coloque o frasco na incubadora a 37˚C durante a noite.
  5. No dia seguinte, observe no microscópio para garantir que as células estejam aderidas.
  6. Remova o meio e substitua por um novo meio de crescimento.

Subcultura de linhas celulares PRF

  1. As células devem ser divididas quando confluentes.
  2. Para dividir células (os volumes fornecidos pressupõem que as células estejam em um T25):
    a) Usando técnica estéril, remova o meio e lave o frasco com 2-3 ml de HBSS estéril. Remova e descarte o HBSS.
    b) Adicione 1 ml de tripsina e incube por 2-3 minutos. As células devem ser verificadas sob um microscópio invertido para determinar se elas começaram a se arredondar, levantar e flutuar. Se as células não se soltarem após 3 minutos, você pode incubar por mais 1-2 minutos.
    c) Aperte a tampa e incline suavemente o frasco de um lado para o outro para desalojar todas as células. O frasco pode ser batido levemente na lateral para soltar as células, se necessário.
    d) Adicione 4 ml de novo meio ao frasco assim que as células estiverem flutuando para inativar a tripsina. Enxágue as laterais do frasco várias vezes com o novo meio para lavar todas as células do plástico e para a solução. Remova todo o líquido contendo células e transfira para um recipiente cônico de 15 ml (ou 50 ml se você estiver reunindo 3 ou mais frascos).
    e) Utilizando técnica estéril, retire uma alíquota para contagem em hemocitômetro.
    f) Enquanto você conta as células, o restante da solução deve ser centrifugado na centrífuga clínica por 5 minutos a 1000 rpm.
  3. Após calcular a contagem de células, coloque as células em placas de 2,5 x 105 células por frasco superior com filtro T25.
  4. As células devem ser alimentadas a cada 2-3 dias com meio de crescimento fresco.

Congelamento:

As células devem ser congeladas em pelo menos 5 x 105 células/ml/criotubo em meio de crescimento contendo 10% DMSO e 30% FBS e subsequentemente colocadas em uma câmara de congelamento de isopropanol a -80˚C durante a noite. Transferir para o nitrogênio líquido no dia seguinte.

Protocolo para subcultura e congelamento de fibroblastos

Para mais informações, entre em contato com:

Dr. Leslie B. Gordon, PhD

Professor de Pesquisa Pediátrica Warren Alpert Medical School da Brown University e Departamento de Pediatria, Hasbro Children's Hospital, Providence, RI Departamento de Anestesia, Children's Hospital Boston e Harvard Medical School, Boston, MA Diretor Médico, The Progeria Research Foundation

Telefone: 978-535-2594
Fax: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

Wendy Norris
Banco de células e tecidos PRF
Telefone: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org
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