Célula fibroblástica
Protocolos Culturais
Protocolo para subcultura e congelamento de fibroblastos
Mídia de crescimento
DMEM – ThermoFisher #11960-044 (alta glicose sem L-glutamina)
15% FBS Soro Fetal Bovino – ThermoFisher #10437-028
1% (1X) Penicilina-Estreptomicina – ThermoFisher #15140-122
1% (1X) GlutaMAX – TermoFisher #35050-061
Tripsina
Tripsina EDTA C 0,25% (ThermoFisher #25200-056)
Solução salina balanceada de Hank
HBSS- (ThermoFisher #14170 (1X) (-) cloreto de cálcio, (-) cloreto de magnésio, (-) sulfato de magnésio
DMSO para Congelamento
Grau de cultura de células DMSO – Sigma #D2438
Descongelamento de linhas celulares PRF
- Descongele as células rapidamente em banho-maria a 37˚C.
- Limpe a parte externa do frasco com etanol 70%.
- Transfira as células descongeladas para um frasco T25 contendo 5 ml de meio de crescimento.
- Coloque o frasco na incubadora a 37˚C durante a noite.
- No dia seguinte, observe no microscópio para garantir que as células estejam aderidas.
- Remova o meio e substitua por um novo meio de crescimento.
Subcultura de linhas celulares PRF
- As células devem ser divididas quando confluentes.
- Para dividir células (os volumes fornecidos pressupõem que as células estejam em um T25):
a) Usando técnica estéril, remova o meio e lave o frasco com 2-3 ml de HBSS estéril. Remova e descarte o HBSS.
b) Adicione 1 ml de tripsina e incube por 2-3 minutos. As células devem ser verificadas sob um microscópio invertido para determinar se elas começaram a se arredondar, levantar e flutuar. Se as células não se soltarem após 3 minutos, você pode incubar por mais 1-2 minutos.
c) Aperte a tampa e incline suavemente o frasco de um lado para o outro para desalojar todas as células. O frasco pode ser batido levemente na lateral para soltar as células, se necessário.
d) Adicione 4 ml de novo meio ao frasco assim que as células estiverem flutuando para inativar a tripsina. Enxágue as laterais do frasco várias vezes com o novo meio para lavar todas as células do plástico e para a solução. Remova todo o líquido contendo células e transfira para um recipiente cônico de 15 ml (ou 50 ml se você estiver reunindo 3 ou mais frascos).
e) Utilizando técnica estéril, retire uma alíquota para contagem em hemocitômetro.
f) Enquanto você conta as células, o restante da solução deve ser centrifugado na centrífuga clínica por 5 minutos a 1000 rpm. - Após calcular a contagem de células, coloque as células em placas de 2,5 x 105 células por frasco superior com filtro T25.
- As células devem ser alimentadas a cada 2-3 dias com meio de crescimento fresco.
Congelamento:
As células devem ser congeladas em pelo menos 5 x 105 células/ml/criotubo em meio de crescimento contendo 10% DMSO e 30% FBS e subsequentemente colocadas em uma câmara de congelamento de isopropanol a -80˚C durante a noite. Transferir para o nitrogênio líquido no dia seguinte.
Para mais informações, entre em contato com:
Dr. Leslie B. Gordon, PhD
Professor de Pesquisa Pediátrica Warren Alpert Medical School da Brown University e Departamento de Pediatria, Hasbro Children's Hospital, Providence, RI Departamento de Anestesia, Children's Hospital Boston e Harvard Medical School, Boston, MA Diretor Médico, The Progeria Research Foundation
Telefone: 978-535-2594
Fax: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
Wendy Norris
Telefone: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org