फायब्रोब्लास्ट सेल
संस्कृती प्रोटोकॉल
सबकल्चरिंग आणि फ्रीझिंग फायब्रोब्लास्टसाठी प्रोटोकॉल
ग्रोथ मीडिया
DMEM - थर्मोफिशर #11960-044 (एल-ग्लुटामाइनशिवाय उच्च ग्लुकोज)
15% FBS फेटल बोवाइन सीरम - थर्मोफिशर #10437-028
1% (1X) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमायसिन - थर्मोफिशर #15140-122
1% (1X) GlutaMAX - थर्मोफिशर #35050-061
ट्रिप्सिन
ट्रिप्सिन EDTA C 0.25% (थर्मोफिशर #25200-056)
हँकचे संतुलित मीठ समाधान
HBSS- (थर्मोफिशर #14170 (1X) (-) कॅल्शियम क्लोराईड, (-) मॅग्नेशियम क्लोराईड, (-) मॅग्नेशियम सल्फेट
फ्रीझिंगसाठी DMSO
सेल कल्चर ग्रेड DMSO – सिग्मा #D2438
PRF सेल लाईन्स वितळणे
- 37˚C पाण्याच्या आंघोळीमध्ये पेशी वेगाने वितळवा.
- 70% इथेनॉलने कुपीची बाहेरची बाजू पुसून टाका.
- वितळलेल्या पेशी टी25 फ्लास्कमध्ये हस्तांतरित करा ज्यामध्ये 5 मिली ग्रोथ मीडिया आहे.
- फ्लास्क रात्रभर 37˚C इन्क्यूबेटरमध्ये ठेवा.
- पुढील दिवशी, पेशी संलग्न झाल्याची खात्री करण्यासाठी सूक्ष्मदर्शकाखाली निरीक्षण करा.
- मीडिया काढा आणि ताज्या ग्रोथ मीडियासह बदला.
पीआरएफ सेल लाइन्सचे उपसंस्कृती
- संगम असताना पेशी विभाजित केल्या पाहिजेत.
- पेशी विभाजित करण्यासाठी (दिलेले खंड हे गृहीत धरून पेशी T25 मध्ये आहेत):
अ) निर्जंतुकीकरण तंत्राचा वापर करून, माध्यम काढून टाका आणि 2-3 मिली निर्जंतुक HBSS सह फ्लास्क स्वच्छ धुवा. HBSS काढा आणि टाकून द्या.
b) 1 मिली ट्रिप्सिन घाला आणि 2-3 मिनिटे उबवा. पेशी गोलाकार, उचलणे आणि तरंगणे सुरू झाले आहे का हे निर्धारित करण्यासाठी उलट्या सूक्ष्मदर्शकाखाली तपासले पाहिजे. 3 मिनिटांनंतर पेशी विलग न झाल्यास, तुम्ही आणखी 1-2 मिनिटे उष्मायन करू शकता.
c) सर्व पेशी काढून टाकण्यासाठी टोपी घट्ट करा आणि हळूवारपणे फ्लास्क एका बाजूला टीप करा. आवश्यक असल्यास, पेशी सोडविण्यासाठी फ्लास्क बाजूला हलके टॅप केले जाऊ शकते.
ड) ट्रिप्सिन निष्क्रिय करण्यासाठी पेशी फ्लोटिंग होताच फ्लास्कमध्ये 4 मिली नवीन माध्यम जोडा. प्लास्टिकच्या सर्व पेशी धुण्यासाठी आणि द्रावणात नवीन माध्यमाने फ्लास्कच्या बाजू अनेक वेळा स्वच्छ धुवा. पेशी असलेले सर्व द्रव काढून टाका आणि 15 मिली शंकूच्या आकारात (किंवा तुम्ही 3 किंवा अधिक फ्लास्क एकत्र करत असाल तर 50 मिली).
e) निर्जंतुकीकरण तंत्राचा वापर करून, हेमोसाइटोमीटरवर मोजण्यासाठी अलिकट काढा.
f) तुम्ही पेशी मोजत असताना, उर्वरित द्रावण क्लिनिकल सेंट्रीफ्यूजमध्ये 1000 rpm वर 5 मिनिटांसाठी कातले पाहिजे. - तुमच्या सेलच्या संख्येची गणना केल्यानंतर, सेल 2.5 x 10 वर प्लेट करा5 सेल प्रति T25 फिल्टर टॉप फ्लास्क.
- पेशींना दर 2-3 दिवसांनी ताजे वाढीचे माध्यम दिले पाहिजे.
अतिशीत:
सेल 5 x 10 पेक्षा कमी नसावेत5 10% DMSO आणि 30% FBS असलेल्या वाढीच्या माध्यमातील पेशी/ml/cryovial आणि त्यानंतर रात्रभर -80˚C तापमानात isopropanol फ्रीझिंग चेंबरमध्ये ठेवले जाते. दुसऱ्या दिवशी द्रव नायट्रोजनमध्ये स्थानांतरित करा.
अधिक माहितीसाठी कृपया संपर्क साधा:
लेस्ली बी. गॉर्डन, एमडी, पीएचडी
ब्राऊन युनिव्हर्सिटीच्या बालरोग संशोधन वॉरेन अल्पर्ट मेडिकल स्कूलचे प्राध्यापक आणि बालरोग विभाग, हॅस्ब्रो चिल्ड्रन हॉस्पिटल, प्रोव्हिडन्स, आरआय डिपार्टमेंट ऑफ ऍनेस्थेसिया, चिल्ड्रन्स हॉस्पिटल बोस्टन आणि हार्वर्ड मेडिकल स्कूल, बोस्टन, एमए मेडिकल डायरेक्टर, प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशन
फोन: ९७८-५३५-२५९४
फॅक्स: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
वेंडी नॉरिस
फोन: ४०१-२७४-११२२ x ४८०६३
wnorris@brownhealth.org