পৃষ্ঠা নির্বাচন করুন

ফাইব্রোব্লাস্ট সেল

সংস্কৃতি প্রোটোকল

 

সাবকালচারিং এবং ফ্রিজিং ফাইব্রোব্লাস্টের জন্য প্রোটোকল

গ্রোথ মিডিয়া

DMEM - থার্মোফিশার #11960-044 (এল-গ্লুটামিন ছাড়া উচ্চ গ্লুকোজ)

15% FBS ফেটাল বোভাইন সিরাম - থার্মোফিশার #10437-028

1% (1X) পেনিসিলিন-স্ট্রেপ্টোমাইসিন - থার্মোফিশার #15140-122

1% (1X) GlutaMAX – ThermoFisher #35050-061

ট্রিপসিন

ট্রিপসিন EDTA C 0.25% (থার্মোফিশার #25200-056)

হ্যাঙ্কের সুষম লবণ সমাধান

HBSS- (থার্মোফিশার #14170 (1X) (-) ক্যালসিয়াম ক্লোরাইড, (-) ম্যাগনেসিয়াম ক্লোরাইড, (-) ম্যাগনেসিয়াম সালফেট

জমাট বাঁধার জন্য DMSO

সেল কালচার গ্রেড DMSO – সিগমা #D2438

PRF সেল লাইন গলানো

  1. 37˚C জলের স্নানে কোষগুলিকে দ্রুত গলিয়ে ফেলুন।
  2. 70% ইথানল দিয়ে শিশির বাইরের অংশটি মুছুন।
  3. গলিত কোষগুলিকে একটি T25 ফ্লাস্কে স্থানান্তর করুন যাতে 5 মিলি গ্রোথ মিডিয়া থাকে।
  4. রাতারাতি 37˚C ইনকিউবেটরে ফ্লাস্ক রাখুন।
  5. পরের দিন, কোষ সংযুক্ত হয়েছে তা নিশ্চিত করতে মাইক্রোস্কোপের নীচে পর্যবেক্ষণ করুন।
  6. মিডিয়া সরান এবং তাজা বৃদ্ধি মিডিয়া সঙ্গে প্রতিস্থাপন.

সাবকালচারিং PRF সেল লাইন

  1. মিলিত হলে কোষ বিভক্ত করা উচিত।
  2. কোষগুলিকে বিভক্ত করতে (প্রদত্ত ভলিউমগুলি অনুমান করা হচ্ছে যে কোষগুলি একটি T25 এ রয়েছে):
    ক) জীবাণুমুক্ত কৌশল ব্যবহার করে, মিডিয়া অপসারণ করুন এবং 2-3 মিলি জীবাণুমুক্ত HBSS দিয়ে ফ্লাস্ক ধুয়ে ফেলুন। HBSS সরান এবং বাতিল করুন।
    খ) 1 মিলি ট্রিপসিন যোগ করুন এবং 2-3 মিনিটের জন্য সেঁকুন। কোষগুলি গোলাকার, উত্তোলন এবং ভাসতে শুরু করেছে কিনা তা নির্ধারণ করতে একটি উল্টানো মাইক্রোস্কোপের নীচে পরীক্ষা করা উচিত। যদি 3 মিনিটের পরে কোষগুলি বিচ্ছিন্ন না হয় তবে আপনি আরও 1-2 মিনিটের মধ্যে ইনকিউবেট করতে পারেন।
    গ) টুপি শক্ত করুন এবং সমস্ত কোষগুলিকে সরিয়ে দেওয়ার জন্য আলতোভাবে ফ্লাস্কটি পাশ থেকে এপাশে টিপ দিন। প্রয়োজনে কোষ আলগা করতে ফ্লাস্ককে পাশে হালকাভাবে ট্যাপ করা যেতে পারে।
    d) ট্রিপসিন নিষ্ক্রিয় করার জন্য কোষগুলি ভাসানোর সাথে সাথে ফ্লাস্কে 4 মিলি নতুন মিডিয়া যোগ করুন। প্লাস্টিক থেকে সমস্ত কোষ ধুয়ে দ্রবণে নতুন মিডিয়া দিয়ে ফ্লাস্কের পাশগুলি কয়েকবার ধুয়ে ফেলুন। কোষ ধারণকারী সমস্ত তরল সরান এবং একটি 15 মিলি শঙ্কুতে স্থানান্তর করুন (বা 50 মিলি যদি আপনি 3 বা তার বেশি ফ্লাস্ক পুল করেন)।
    e) জীবাণুমুক্ত কৌশল ব্যবহার করে, হিমোসাইটোমিটারে গণনার জন্য একটি অ্যালিকোট সরান।
    f) যখন আপনি কোষ গণনা করছেন, বাকি দ্রবণটি 1000 rpm-এ 5 মিনিটের জন্য ক্লিনিকাল সেন্ট্রিফিউজে কাটা উচিত।
  3. আপনার সেল সংখ্যা গণনা করার পরে, 2.5 x 10 এ প্লেট সেল5 T25 ফিল্টার শীর্ষ ফ্লাস্ক প্রতি কোষ.
  4. কোষগুলিকে প্রতি 2-3 দিনে তাজা বৃদ্ধির মাধ্যম দিয়ে খাওয়ানো উচিত।

জমে যাওয়া:

কোষগুলি 5 x 10 এর কম নয় হিমায়িত করা উচিত5 10% DMSO এবং 30% FBS ধারণকারী গ্রোথ মিডিয়াতে কোষ/ml/cryovial এবং পরবর্তীতে রাতারাতি -80˚C তাপমাত্রায় একটি আইসোপ্রোপ্যানল ফ্রিজিং চেম্বারে রাখা হয়। পরের দিন তরল নাইট্রোজেনে স্থানান্তর করুন।

সাবকালচারিং এবং ফ্রিজিং ফাইব্রোব্লাস্টের জন্য প্রোটোকল

আরও তথ্যের জন্য অনুগ্রহ করে যোগাযোগ করুন:

লেসলি বি গর্ডন, এমডি, পিএইচডি

ব্রাউন ইউনিভার্সিটির পেডিয়াট্রিক্স রিসার্চ ওয়ারেন অ্যালপার্ট মেডিকেল স্কুল এবং পেডিয়াট্রিক্স বিভাগের অধ্যাপক, হাসব্রো চিলড্রেন হাসপাতাল, প্রভিডেন্স, অ্যানেস্থেশিয়ার RI বিভাগ, শিশু হাসপাতাল বোস্টন এবং হার্ভার্ড মেডিকেল স্কুল, বোস্টন, এমএ মেডিকেল ডিরেক্টর, প্রোজেরিয়া রিসার্চ ফাউন্ডেশন

ফোন: 978-535-2594
ফ্যাক্স: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

ওয়েন্ডি নরিস
পিআরএফ সেল এবং টিস্যু ব্যাংক
ফোন: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org
bn_BDBengali