Décongélation de lignées de cellules PRF

1. Décongeler rapidement les cellules dans un bain-marie 37˚C.
2. Essuyez l'extérieur du flacon avec 70% d'éthanol.
3. Transférer les cellules décongelées dans un ballon T25 contenant 5 ml de milieu de croissance.
4. Placer le ballon dans l'incubateur 37˚C pendant la nuit.
5. Le lendemain, observez au microscope pour vous assurer que les cellules sont bien attachées.
6. Retirez le support et remplacez-le par un support de croissance frais.

Sous-culture de lignées de cellules PRF

1. Les cellules doivent être divisées lorsqu'elles sont confluentes.
2. Pour diviser des cellules (les volumes donnés supposent que les cellules se trouvent dans un T25):
   a) En utilisant une technique stérile, retirer le milieu et rincer le ballon avec 2-3 ml de HBSS stérile. Retirez et jetez HBSS.
   b) Ajouter 1 ml de trypsine et incuber pendant 2-3 minutes. Les cellules doivent être vérifiées au microscope inversé pour déterminer si elles ont commencé à s'arrondir, à se soulever et à flotter. Si les cellules ne se détachent pas après 3 minutes, vous pouvez incuber encore 1 à 2 minutes.
   c) Serrez le capuchon et inclinez doucement le flacon d'un côté à l'autre pour déloger toutes les cellules. Le flacon peut être légèrement tapoté sur le côté pour desserrer les cellules si nécessaire.
   d) Ajouter 4 ml de nouveau milieu au flacon dès que les cellules flottent pour inactiver la trypsine. Rincer les côtés du ballon plusieurs fois avec le nouveau support pour laver toutes les cellules du plastique et dans la solution. Retirez toutes les cellules contenant du liquide et transférez-les dans un récipient conique de 15 ml (ou 50 ml si vous rassemblez 3 flacons ou plus).
   e) En utilisant une technique stérile, prélever une aliquote pour compter sur un hémocytomètre.
   f) Pendant que vous comptez les cellules, le reste de la solution doit être centrifugé dans la centrifugeuse clinique pendant 5 minutes à 1000 tr / min.
3. Après avoir calculé le nombre de vos cellules, les cellules en plaques sous 2.5 x 10⁵ cellules par flacon supérieur filtrant T25.
4. Les cellules doivent être nourries tous les jours avec 2-3 avec un milieu de croissance frais.

Gel:

Les cellules doivent être congelées à au moins 5 x 10⁵ cellules / ml / cryovial dans des milieux de croissance contenant 10% de DMSO et 30% de FBS et ensuite placés dans une chambre de congélation d'isopropanol à -80 ° C pendant une nuit. Transférer à l'azote liquide le lendemain.

Protocole pour les fibroblastes de sous-culture et de congélation