Оттаивание клеточных линий PRF

1. Клетки быстро оттаивают в водяной бане 37˚C.
2. Протрите флакон снаружи 70% этанолом.
3. Перенести оттаявшие клетки в колбу T25, содержащую 5 мл питательной среды.
4. Поместите колбу в инкубатор 37˚C на ночь.
5. На следующий день наблюдайте под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки прикрепились.
6. Удалите носитель и замените его свежим носителем.

Субкультивирование клеточных линий PRF

1. Клетки должны быть разделены при слиянии.
2. Чтобы разделить ячейки (данные объемы предполагают, что ячейки находятся в T25):
   а) Используя стерильную технику, удалите среду и промойте колбу 2–3 мл стерильного HBSS. Удалите и выбросьте HBSS.
   б) Добавьте 1 мл трипсина и инкубируйте 2-3 минуты. Клетки следует проверить под инвертированным микроскопом, чтобы определить, начали ли они округляться, подниматься и плавать. Если клетки не отделяются через 3 минуты, вы можете инкубировать еще 1-2 минуты.
   c) Затяните крышку и осторожно наклоните колбу из стороны в сторону, чтобы удалить все клетки. При необходимости колбу можно слегка постучать по бокам, чтобы ослабить клетки.
   г) Добавьте в колбу 4 мл новой среды, как только клетки всплывут, чтобы инактивировать трипсин. Промойте стенки колбы несколько раз новой средой, чтобы смыть все клетки с пластика и погрузить в раствор. Удалите всю жидкость, содержащую клетки, и перенесите в коническую емкость на 15 мл (или на 50 мл, если вы собираете 3 или более колб).
   д) Используя стерильную технику, удалите аликвоту для подсчета на гемоцитометре.
   е) Пока вы подсчитываете клетки, оставшуюся часть раствора следует вращать в клинической центрифуге в течение 5 минут при 1000 об / мин.
3. После расчета количества клеток, ячеек планшета на 2.5 x 10⁵ ячеек на колбу фильтра T25.
4. Клетки следует кормить каждые 2-3 дней свежей питательной средой.

Замораживание:

Клетки должны быть заморожены не менее чем 5 x 10⁵ клеток / мл / криопробирка в среде для выращивания, содержащей 10% ДМСО и 30% FBS, а затем помещают в камеру для замораживания изопропанола при -80 ° C на ночь. На следующий день переводят на жидкий азот.

Протокол для субкультивирования и замораживания фибробластов