PRF سیل لائنوں کو پگھلانا

1. 37˚C پانی کے غسل میں خلیوں کو تیزی سے پگھلا دیں۔
2. 70% ایتھنول سے شیشی کے باہر کا حصہ صاف کریں۔
3. پگھلے ہوئے خلیوں کو T25 فلاسک میں منتقل کریں جس میں 5 ملی لیٹر گروتھ میڈیا ہو۔
4. فلاسک کو رات بھر 37˚C انکیوبیٹر میں رکھیں۔
5. اگلے دن، خلیات منسلک ہونے کو یقینی بنانے کے لیے خوردبین کے نیچے مشاہدہ کریں۔
6. میڈیا کو ہٹا دیں اور تازہ گروتھ میڈیا سے تبدیل کریں۔

PRF سیل لائنوں کی ذیلی ثقافت

1. جب آپس میں ملتے ہیں تو خلیوں کو تقسیم کیا جانا چاہئے۔
2. خلیات کو تقسیم کرنے کے لیے (دیے گئے حجم یہ فرض کر رہے ہیں کہ خلیات T25 میں ہیں):
   a) جراثیم سے پاک تکنیک کا استعمال کرتے ہوئے، میڈیا کو ہٹا دیں اور فلاسک کو 2-3 ملی لیٹر جراثیم سے پاک HBSS سے دھو لیں۔ HBSS کو ہٹائیں اور ضائع کریں۔
   ب) 1 ملی لیٹر ٹرپسن شامل کریں اور 2-3 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔ خلیات کو الٹی خوردبین کے نیچے چیک کیا جانا چاہئے تاکہ یہ معلوم کیا جا سکے کہ آیا انہوں نے گول کرنا، اٹھانا اور تیرنا شروع کر دیا ہے۔ اگر خلیات 3 منٹ کے بعد الگ نہیں ہوتے ہیں، تو آپ مزید 1-2 منٹ تک انکیوبیٹ کر سکتے ہیں۔
   c) ٹوپی کو سخت کریں اور آہستہ سے فلاسک کو ایک طرف سے دوسری طرف ٹپ کریں تاکہ تمام خلیات کو خارج کیا جاسکے۔ اگر ضرورت ہو تو خلیات کو ڈھیلا کرنے کے لیے فلاسک کو ایک طرف ہلکے سے ٹیپ کیا جا سکتا ہے۔
   d) جیسے ہی خلیے ٹرپسن کو غیر فعال کرنے کے لیے تیر رہے ہوں فلاسک میں 4 ملی لیٹر نیا میڈیا شامل کریں۔ فلاسک کے اطراف کو کئی بار نئے میڈیا کے ساتھ کللا کریں تاکہ تمام خلیات کو پلاسٹک سے اور محلول میں دھویا جا سکے۔ خلیوں پر مشتمل تمام مائع کو ہٹا دیں اور 15 ملی لیٹر مخروطی (یا 50 ملی لیٹر اگر آپ 3 یا اس سے زیادہ فلاسکس جمع کر رہے ہیں) میں منتقل کریں۔
   e) جراثیم سے پاک تکنیک کا استعمال کرتے ہوئے، ہیمو سائیٹومیٹر پر شمار کرنے کے لیے ایک ایلی کوٹ کو ہٹا دیں۔
   f) جب آپ خلیات کی گنتی کر رہے ہیں، باقی محلول کو 1000 rpm پر 5 منٹ کے لیے کلینکل سینٹری فیوج میں کاتا جانا چاہیے۔
3. اپنے سیل کی گنتی کا حساب لگانے کے بعد، سیل کو 2.5 x 10 پر پلیٹ کریں۔⁵ سیل فی T25 فلٹر ٹاپ فلاسک۔
4. خلیوں کو ہر 2-3 دن بعد تازہ نشوونما کے ذریعہ کھلایا جانا چاہئے۔

جمنا:

خلیوں کو 5 x 10 سے کم پر منجمد کیا جانا چاہئے۔⁵ 10% DMSO اور 30% FBS پر مشتمل گروتھ میڈیا میں خلیات/ml/cryovial اور بعد میں راتوں رات -80˚C پر ایک isopropanol فریزنگ چیمبر میں رکھا جاتا ہے۔ اگلے دن مائع نائٹروجن میں منتقل کریں۔

ذیلی ثقافت اور منجمد فائبرو بلاسٹس کے لیے پروٹوکول