پی آر ایف سیل لائنیں پگھلا رہے ہیں

1. 37˚C پانی کے غسل میں خلیوں کو تیزی سے پگھلا دو۔
2. 70٪ ایتھنول کے ساتھ شیشی کے باہر کا صفایا کریں۔
3. پگھلے ہوئے خلیوں کو ایک T25 فلاسک میں منتقل کریں جس میں نمو میڈیا کے 5 ملی لیٹر ہیں۔
4. رات بھر 37˚C انکیوبیٹر میں فلاسک رکھیں۔
5. اگلے دن ، خلیوں کے ساتھ منسلک ہونے کو یقینی بنانے کے لئے خوردبین کے نیچے مشاہدہ کریں۔
6. میڈیا کو ہٹا دیں اور تازہ نمو والے میڈیا کے ساتھ تبدیل کریں۔

ذیلی ثقافتی PRF سیل لائنیں

1. سنگم ہونے پر خلیوں کو تقسیم کرنا چاہئے۔
2. خلیوں کو تقسیم کرنے کے ل given (دی گئی مقدار میں یہ فرض کیا جارہا ہے کہ خلیات T25 میں ہیں):
   a) جراثیم سے پاک تکنیک کا استعمال کرتے ہوئے ، میڈیا کو ہٹا دیں اور فلاسک کو جراثیم سے پاک HBSS کے 2-3 ملی لیٹر سے کللا کریں۔ HBSS کو ہٹا دیں اور خارج کردیں۔
   ب) 1 ملی ٹرپسن ڈالیں اور 2-3 منٹ تک انکب کریں۔ سیلوں کو الٹی مائکروسکوپ کے نیچے چیک کرنا چاہئے تاکہ یہ معلوم کیا جاسکے کہ انہوں نے پکڑ دھکڑ ، لفٹ اور تیرنا شروع کردیا ہے یا نہیں۔ اگر خلیوں کو 3 منٹ کے بعد علیحدہ نہ کیا گیا تو ، آپ دوسرا 1-2 منٹ تک پھیل سکتے ہیں۔
   ج) تمام خلیوں کو بے دخل کرنے کے ل cap ٹوپی کو مضبوطی سے اور آہستہ سے فلاسک کا اشارہ کریں۔ ضرورت پڑنے پر خلیوں کو ڈھیلنے کے لئے فلاسک کو ہلکے سے ٹیپ کیا جاسکتا ہے۔
   د) جیسے ہی سیل ٹرپسن کو غیر فعال کرنے کے ل flo تیر رہے ہوتے ہیں ، فلاسک میں 4 ملی لیٹر نیا میڈیا شامل کریں۔ پلاسٹک سے دور اور حل میں تمام خلیوں کو دھونے کے لئے کئی بار نئے میڈیا کے ساتھ فلاسک کے اطراف کللا دیں۔ تمام مائع والے خلیوں کو ہٹا دیں اور 15 ملی لیٹر مخروط میں منتقل کریں (یا اگر آپ 50 یا اس سے زیادہ فلاسکس لگا رہے ہو تو 3 ملی لیٹر)۔
   e) جراثیم سے پاک تکنیک کا استعمال کرتے ہوئے ، ہیموسیومیٹر پر گنتی کے لئے ایک الیوکوٹ کو ہٹا دیں۔
   f) جب آپ خلیوں کی گنتی کررہے ہیں تو ، باقی حل کلینکل سنٹری فیوج میں 5 منٹ پر 1000 منٹ کے لئے ڈالا جانا چاہئے۔
3. اپنے سیل گنتی کا حساب لگانے کے بعد ، 2.5 x 10 پر پلیٹ سیلز⁵ سیل فی T25 فلٹر ٹاپ فلاسک۔
4. خلیوں کو ہر 2-3 دن میں تازہ نمو کے ذریعہ کھلایا جانا چاہئے۔

منجمد:

خلیات کو 5 x 10 سے کم نہیں منجمد ہونا چاہئے⁵ 10٪ DMSO اور 30٪ FBS پر مشتمل نشوونما میڈیا میں خلیوں / ملی / cryovial اور اس کے بعد -80˚C پر رات کو ایک isopropanol منجمد چیمبر میں رکھا گیا۔ اگلے دن مائع نائٹروجن میں منتقل کریں۔

پروٹوکول برائے ذیلی ثقافت اور فریزوبلاسٹس کو منجمد کرنا