ذوبان خطوط الخلايا PRF

1. ذوبان الخلايا بسرعة في حمام مائي 37˚C.
2. امسح الجزء الخارجي من القارورة باستخدام 70٪ من الإيثانول.
3. نقل الخلايا المذابة إلى قارورة T25 تحتوي على 5 مل من وسائط النمو.
4. ضع قارورة في حاضنة 37˚C بين عشية وضحاها.
5. في اليوم التالي ، لاحظ تحت المجهر للتأكد من تعلق الخلايا.
6. قم بإزالة الوسائط واستبدالها بوسائط نمو جديدة.

subculturing خطوط الخلايا PRF

1. يجب تقسيم الخلايا عند التقاء.
2. لتقسيم الخلايا (تفترض وحدات التخزين المقدمة أن الخلايا موجودة في T25):
   أ) باستخدام تقنية معقمة ، قم بإزالة الوسائط وشطف القارورة بـ 2-3 مل من HBSS المعقم. إزالة وتجاهل HBSS.
   ب) أضف 1 مل من التربسين واحتضانها لمدة 2-3 دقائق. يجب فحص الخلايا تحت مجهر مقلوب لتحديد ما إذا كانت قد بدأت في التقريب والرفع والطفو. إذا لم يتم فصل الخلايا بعد 3 دقائق ، يمكنك احتضان 1-2 دقيقة أخرى.
   ج) قم بربط الغطاء وإغلاق القارورة برفق من جانب إلى آخر لإخراج جميع الخلايا. يمكن استغلال القارورة برفق على جانبها لتفكيك الخلايا إذا لزم الأمر.
   د) أضف 4 مل من الوسائط الجديدة إلى القارورة بمجرد أن تطفو الخلايا لتعطيل التربسين. اشطف جوانب القارورة عدة مرات بالوسائط الجديدة لغسل جميع الخلايا من البلاستيك وإدخالها في المحلول. قم بإزالة جميع الخلايا التي تحتوي على السائل ونقلها إلى مخروطي بحجم 15 مل (أو 50 مل إذا كنت تقوم بتجميع 3 قوارير أو أكثر).
   هـ) باستخدام تقنية معقمة ، قم بإزالة قسامة للعد على مقياس الهيموسيتومتر.
   و) أثناء عد الخلايا ، يجب تدوير باقي المحلول في جهاز الطرد المركزي السريري لمدة 5 دقائق عند 1000 دورة في الدقيقة.
3. بعد حساب عدد الخلايا الخاصة بك ، خلايا لوحة في 2.5 x 10⁵ الخلايا لكل T25 تصفية القارورة العليا.
4. يجب تغذية الخلايا كل يوم 2-3 بوسط نمو جديد.

تجميد:

يجب تجميد الخلايا في 5 x 10 على الأقل⁵ الخلايا / مل / كريوفال في وسائط النمو التي تحتوي على 10٪ DMSO و 30٪ FBS ثم توضع لاحقًا في غرفة تجميد الأيزوبروبانول عند -80 درجة مئوية طوال الليل. ينقل إلى النيتروجين السائل في اليوم التالي.

بروتوكول لثقافة وتجميد الخلايا الليفية