Розморожування клітинних ліній PRF

1. Швидко розморозьте клітини на водяній бані при 37˚C.
2. Протріть флакон зовні етанолом 70%.
3. Перенесіть розморожені клітини в колбу T25, що містить 5 мл середовища для росту.
4. Помістіть колбу в інкубатор при 37°C на ніч.
5. Наступного дня спостерігайте під мікроскопом, щоб переконатися, що клітини прикріпилися.
6. Видаліть середовище та замініть його свіжим середовищем для росту.

Субкультура клітинних ліній PRF

1. Клітини повинні бути розділені, коли зливаються.
2. Щоб розділити клітинки (наведені обсяги припускаються, що клітинки знаходяться в T25):
   a) Використовуючи стерильну техніку, видаліть середовище та промийте колбу 2-3 мл стерильного HBSS. Видаліть і викиньте HBSS.
   b) Додайте 1 мл трипсину та інкубуйте 2-3 хвилини. Клітини слід перевірити під інвертованим мікроскопом, щоб визначити, чи почали вони округлятися, підніматися та спливати. Якщо клітини не відокремлюються через 3 хвилини, ви можете інкубувати ще 1-2 хвилини.
   c) Затягніть кришку та обережно перехиліть колбу з боку в бік, щоб видалити всі клітини. За потреби колбу можна злегка постукати збоку, щоб послабити клітини.
   d) Додайте 4 мл нового середовища в колбу, як тільки клітини спливуть, щоб інактивувати трипсин. Кілька разів промийте стінки колби новим середовищем, щоб змити всі клітини з пластику та потрапити в розчин. Видаліть всю рідину, що містить клітини, і перенесіть у конічну колбу об’ємом 15 мл (або 50 мл, якщо ви об’єднуєте 3 або більше колб).
   д) Використовуючи стерильну техніку, відберіть аліквоту для підрахунку на гемоцитометрі.
   f) Поки ви підраховуєте клітини, решту розчину слід обертати в клінічній центрифузі протягом 5 хвилин при 1000 об/хв.
3. Після підрахунку кількості клітин помістіть клітини розміром 2,5 x 10⁵ клітин на верхню колбу фільтра T25.
4. Кожні 2-3 дні клітини слід підживлювати свіжим живильним середовищем.

Заморожування:

Клітини слід заморозити не менше ніж 5 x 10⁵ клітин/мл/кріопробірку в середовищі для росту, що містить 10% DMSO і 30% FBS, а потім поміщають в ізопропанолову морозильну камеру при -80˚C на ніч. Наступного дня переведіть у рідкий азот.

Протокол субкультивування та заморожування фібробластів