Відтавання клітинних ліній PRF

1. Клітини відтають швидко на водяній бані 37˚C.
2. Протріть зовнішню сторону флакона 70% етанолом.
3. Перенесли розморожені клітини в колбу T25, що містить 5 мл середовища для росту.
4. Поставте колбу в інкубатор 37˚C на ніч.
5. Наступного дня спостерігайте під мікроскопом, щоб переконатися, що клітини прикріпилися.
6. Видаліть носії та замініть свіжими носіями для росту.

Субкультура PR-клітинних ліній

1. Клітини повинні бути розбиті при злитті.
2. Для поділу комірок (задані обсяги, якщо припускати, що клітини знаходяться в T25):
   а) За допомогою стерильної техніки видаліть середовище та промийте колбу 2-3 мл стерильного HBSS. Видаліть і відкиньте HBSS.
   б) Додайте 1 мл трипсину та інкубуйте протягом 2-3 хвилин. Клітини слід перевіряти під перевернутим мікроскопом, щоб визначити, чи не почали вони округлятися, підніматися і плавати. Якщо клітини не відшаруються через 3 хвилини, ви можете інкубувати ще 1-2 хвилини.
   в) Затягніть ковпачок і акуратно наконечник колби з боку в бік, щоб зрушити всі клітини. Якщо потрібно, колбу можна легенько постукати по боці, щоб ослабити клітини.
   г) Додайте в колбу 4 мл нового середовища, як тільки клітини плавають, щоб інактивувати трипсин. Декілька разів промийте боки колби новим середовищем, щоб змити всі клітини з пластику та увійти у розчин. Видаліть всю рідину, що містить клітини, і перекладіть у конічну ємність об'ємом 15 мл (або 50 мл, якщо ви збираєте 3 або більше колб).
   д) За допомогою стерильної техніки видаліть аліквоту для підрахунку на гемоцитометрі.
   f) Поки ви підраховуєте клітини, решту розчину слід обертати в клінічній центрифузі протягом 5 хвилин при 1000 об / хв.
3. Після підрахунку кількості клітинок, пластинчасті клітини на 2.5 x 10⁵ комірки на верхню колбу фільтра T25.
4. Клітини слід годувати кожні 2-3 дня свіжим ростовим середовищем.

Заморожування:

Клітини повинні бути заморожені не менше ніж 5 x 10⁵ клітини / мл / кріовіал у середовищах для росту, що містять 10% ДМСО і 30% FBS, і згодом поміщають у морозильну камеру ізопропанолу при -80 ° С на ніч. Перевести в рідкий азот наступного дня.

Протокол субкультурації та заморожування фібробластів