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Fibroblast Cell

Kulturprotokolle

 

Protokoll für die Subkultur und das Einfrieren von Fibroblasten

Wachstumsmedien

DMEM - ThermoFisher # 11960-044 (hohe Glukose ohne L-Glutamin)

15% FBS Fötales Rinderserum - ThermoFisher # 10437-028

1% (1X) Penicillin-Streptomycin - ThermoFisher # 15140-122

1% (1X) GlutaMAX - ThermoFisher # 35050-061

Trypsin

Trypsin EDTA C 0.25% (ThermoFisher # 25200-056)

Hanks ausgewogene Salzlösung

HBSS- (ThermoFisher #14170 (1X) (-) Calciumchlorid, (-) Magnesiumchlorid, (-) Magnesiumsulfat

DMSO zum Einfrieren

Zellkulturgrad DMSO - Sigma #D2438

PRF-Zelllinien auftauen

  1. Tauen Sie die Zellen schnell in einem 37˚C-Wasserbad auf.
  2. Wischen Sie die Außenseite der Durchstechflasche mit 70% Ethanol ab.
  3. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen in einen T25-Kolben, der 5 ml Wachstumsmedium enthält.
  4. Den Kolben über Nacht in den 37˚C-Inkubator stellen.
  5. Beobachten Sie am nächsten Tag unter dem Mikroskop, ob die Zellen angeheftet sind.
  6. Entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie es durch frisches Wachstumsmedium.

Subkultur von PRF-Zelllinien

  1. Zellen sollten geteilt werden, wenn sie zusammenfließen.
  2. So teilen Sie Zellen (die angegebenen Volumes setzen voraus, dass sich die Zellen in einem T25 befinden):
    a) Entfernen Sie das Medium mit einer sterilen Technik und spülen Sie den Kolben mit 2-3 ml sterilem HBSS aus. Entfernen und entsorgen Sie HBSS.
    b) 1 ml Trypsin hinzufügen und 2-3 Minuten inkubieren. Die Zellen sollten unter einem Umkehrmikroskop überprüft werden, um festzustellen, ob sie sich zu runden, anzuheben und zu schweben begonnen haben. Wenn sich die Zellen nach 3 Minuten nicht ablösen, können Sie weitere 1-2 Minuten inkubieren.
    c) Ziehen Sie die Kappe fest und kippen Sie den Kolben vorsichtig von einer Seite zur anderen, um alle Zellen zu entfernen. Der Kolben kann leicht auf die Seite geklopft werden, um die Zellen bei Bedarf zu lösen.
    d) 4 ml neues Medium in den Kolben geben, sobald die Zellen schwimmen, um das Trypsin zu inaktivieren. Spülen Sie die Seiten des Kolbens mehrmals mit dem neuen Medium ab, um alle Zellen vom Kunststoff in die Lösung zu waschen. Entfernen Sie alle flüssigkeitshaltigen Zellen und geben Sie sie in einen konischen 15-ml-Behälter (oder 50 ml, wenn Sie 3 oder mehr Kolben bündeln).
    e) Entfernen Sie mit einer sterilen Technik ein Aliquot, um mit einem Hämozytometer zu zählen.
    f) Während Sie die Zellen zählen, sollte der Rest der Lösung 5 Minuten lang bei 1000 U / min in der klinischen Zentrifuge zentrifugiert werden.
  3. Nachdem Sie Ihre Zellenzahl berechnet haben, plattieren Sie die Zellen bei 2.5 x 105 Zellen pro T25-Filterkolben.
  4. Die Zellen sollten alle 2-3 Tage mit frischem Wachstumsmedium gefüttert werden.

Einfrieren:

Zellen sollten mit mindestens 5 x 10 eingefroren werden5 Zellen / ml / Kryovial in Wachstumsmedien, die 10% DMSO und 30% FBS enthielten und anschließend über Nacht bei -80 ° C in eine Isopropanol-Gefrierkammer gegeben wurden. Am nächsten Tag in den flüssigen Stickstoff überführen.

Protokoll für die Subkultur und das Einfrieren von Fibroblasten

Für weitere Informationen kontaktieren Sie bitte:

Leslie B. Gordon, MD, PhD

Professor für Pädiatrieforschung Warren Alpert Medical School der Brown University und Abteilung für Pädiatrie, Hasbro Kinderkrankenhaus, Providence, RI Abteilung für Anästhesie, Kinderkrankenhaus Boston und Harvard Medical School, Boston, MA Ärztlicher Direktor, The Progeria Research Foundation

Telefon: 978-535-2594
Fax: 508-543-0377
Leslie_Gordon@brown.edu

Wendy Norris
PRF Cell and Tissue Bank
Telefon: 401-274-1122 x 48063
wnorris@lifespan.org