Бетті таңдаңыз

Фибробласт жасушасы

Мәдениет хаттамалары

 

Фибробласттарды субкультуралау және мұздату хаттамасы

Өсу медиасы

DMEM – ThermoFisher #11960-044 (L-глутаминсіз жоғары глюкоза)

15% FBS ұрықтың сиыр сарысуы – ThermoFisher #10437-028

1% (1X) пенициллин-стрептомицин – ThermoFisher #15140-122

1% (1X) GlutaMAX – ThermoFisher #35050-061

Трипсин

Трипсин EDTA C 0.25% (ThermoFisher #25200-056)

Хэнктің теңдестірілген тұз ерітіндісі

HBSS- (ThermoFisher #14170 (1X) (-) кальций хлориді, (-) магний хлориді, (-) магний сульфаты

Мұздату үшін DMSO

Жасуша мәдениетінің дәрежесі DMSO – Sigma #D2438

PRF жасуша сызықтарын еріту

  1. 37˚C су моншасында жасушаларды тез ерітіңіз.
  2. Құты сыртын 70% этанолымен сүртіңіз.
  3. Ерітілген жасушаларды 5 мл өсу ортасы бар T25 колбасына ауыстырыңыз.
  4. Колбаны түні бойы 37˚С инкубаторға салыңыз.
  5. Келесі күні жасушалардың бекітілгеніне көз жеткізу үшін микроскоп астында бақылаңыз.
  6. Баспа құралын алып тастап, жаңа өсу ортасымен ауыстырыңыз.

PRF жасуша желілерін субкультуралау

  1. Біріктірілген кезде жасушалар бөлінуі керек.
  2. Ұяшықтарды бөлу үшін (берілген көлемдер ұяшықтар T25-те болса керек):
    а) Стерильді техниканы қолданып, баспа материалын алып, колбаны 2-3 мл стерильді HBSS ерітіндісімен шайыңыз. HBSS жою және жою.
    б) 1 мл трипсин қосып, 2-3 минут инкубациялайды. Жасушалардың дөңгелектене бастағанын, көтеріле бастағанын және қалқып кеткенін анықтау үшін инверттелген микроскоптың астында тексеру керек. Егер жасушалар 3 минуттан кейін ажырамаса, тағы 1-2 минут инкубациялауға болады.
    c) Барлық жасушаларды шығару үшін қақпақты жабыңыз және колбаны бір жағынан екінші жағына ақырын төңкеріңіз. Қажет болса, ұяшықтарды босату үшін колбаны бүйірінен аздап соғуға болады.
    г) Трипсинді инактивациялау үшін жасушалар қалқыған кезде колбаға 4 мл жаңа ортаны қосыңыз. Барлық жасушаларды пластмассадан жуып, ерітіндіге салу үшін колбаның бүйір жақтарын жаңа баспа құралдарымен бірнеше рет шайыңыз. Барлық сұйықтық бар жасушаларды алып тастаңыз және 15 мл конустық пішінге (немесе 3 немесе одан да көп колбаны біріктіріп жатсаңыз, 50 мл) ауыстырыңыз.
    e) Стерильді техниканы қолданып, гемоцитометрде санау үшін аликвотты алыңыз.
    f) Сіз жасушаларды санап жатқанда, ерітіндінің қалған бөлігін клиникалық центрифугада 5 минут бойы 1000 айн/мин айналдыру керек.
  3. Ұяшықтар санын есептегеннен кейін, ұяшықтарды 2,5 x 10 өлшемімен орналастырыңыз5 T25 сүзгі үстіңгі колбаға жасушалар.
  4. Жасушаларды әр 2-3 күн сайын жаңа өсу ортасымен қоректендіру керек.

Мұздату:

Ұяшықтар 5 х 10 кем емес мұздатылған болуы керек5 10% DMSO және 30% FBS бар өсу ортасындағы жасушалар/мл/криовиал және кейіннен изопропанолды мұздату камерасына түні бойы -80˚C температурада орналастырылған. Келесі күні сұйық азотқа ауыстырыңыз.

Фибробласттарды субкультуралау және мұздату хаттамасы

Қосымша ақпарат алу үшін хабарласыңыз:

Лесли Б. Гордон, MD, PhD

Браун университетінің педиатрия зерттеулерінің профессоры Уоррен Альперт медициналық мектебі және педиатрия кафедрасы, Хасбро балалар ауруханасы, Провиденс, RI анестезия бөлімі, Бостон балалар ауруханасы және Гарвард медициналық мектебі, Бостон, MA медициналық директоры, Progeria зерттеу қоры

Телефон: 978-535-2594
Факс: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

Венди Норрис
PRF жасуша және ұлпа банкі
Телефон: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org
kkKazakh