תא פיברובלסט
פרוטוקולי תרבות
פרוטוקול לתת-תרבות והקפאת פיברובלסטים
אמצעי צמיחה
DMEM – ThermoFisher #11960-044 (גלוקוז גבוה ללא L-גלוטמין)
15% FBS סרום בקר עוברי – ThermoFisher #10437-028
1% (1X) פניצילין-סטרפטומיצין – ThermoFisher #15140-122
1% (1X) GlutaMAX – ThermoFisher #35050-061
טריפסין
טריפסין EDTA C 0.25% (ThermoFisher #25200-056)
תמיסת המלח המאוזנת של האנק
HBSS- (ThermoFisher #14170 (1X) (-) סידן כלורי, (-) מגנזיום כלוריד, (-) מגנזיום גופרתי
DMSO להקפאה
דרגת תרבות תא DMSO – Sigma #D2438
הפשרה של קווי תאים PRF
- הפשרה מהירה של תאים באמבט מים של 37˚C.
- נגב את החלק החיצוני של הבקבוקון עם אתנול 70%.
- העבירו את התאים המופשרים לבקבוק T25 המכיל 5 מ"ל של אמצעי גידול.
- מניחים את הבקבוק באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- למחרת, התבוננו מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים מחוברים.
- הסר את המדיה והחלף בחומר גידול טרי.
תת-תרבות שורות תאים PRF
- יש לפצל תאים כאשר הם מתכנסים.
- כדי לפצל תאים (הנפחים הניתנים בהנחה שהתאים נמצאים ב-T25):
א) בטכניקה סטרילית, הסר את המדיה ושטוף את הבקבוק ב-2-3 מ"ל של HBSS סטרילי. הסר והסר את HBSS.
ב) הוסף 1 מ"ל טריפסין ודגירה במשך 2-3 דקות. יש לבדוק תאים תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לקבוע אם הם החלו להתעגל למעלה, להתרומם ולצוף. אם התאים אינם מנותקים לאחר 3 דקות, ניתן לדגור עוד 1-2 דקות.
ג) הדקו את המכסה והטיפו בעדינות את הבקבוק מצד לצד כדי לעקור את כל התאים. ניתן להקיש קלות על הבקבוק על הצד כדי לשחרר את התאים במידת הצורך.
ד) הוסף 4 מ"ל של מדיה חדשה לבקבוק ברגע שהתאים צפים כדי להשבית את הטריפסין. שטפו את הצדדים של הבקבוק מספר פעמים עם המדיה החדשה כדי לשטוף את כל התאים מהפלסטיק ולתמיסה. הסר את כל התאים המכילים נוזלים והעבר לקוני של 15 מ"ל (או 50 מ"ל אם אתה מאחד 3 צלוחיות או יותר).
ה) באמצעות טכניקה סטרילית, הסר מנה לספירה על המוציטומטר.
ו) בזמן שאתה סופר תאים, יש לסובב את שאר התמיסה בצנטריפוגה הקלינית למשך 5 דקות ב-1000 סל"ד. - לאחר חישוב ספירת התאים, צלחו את התאים ב-2.5 על 105 תאים לכל בקבוק עליון מסנן T25.
- יש להאכיל תאים כל 2-3 ימים במצע גידול טרי.
קְפִיאָה:
יש להקפיא את התאים בגודל של לא פחות מ-5 על 105 תאים/ml/cryovial במצעי גידול המכילים 10% DMSO ו-30% FBS ולאחר מכן הונח בתא הקפאה של איזופרופנול ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. מעבירים לחנקן הנוזלי למחרת.
למידע נוסף אנא צור קשר:
לסלי ב. גורדון, MD, PhD
פרופסור לחקר רפואת ילדים וורן אלפרט בית הספר לרפואה של אוניברסיטת בראון ומחלקה לרפואת ילדים, בית החולים לילדים הסברו, פרובידנס, מחלקת הרדמה RI, בית החולים לילדים בוסטון ובית הספר לרפואה של הרווארד, בוסטון, מנהל רפואי MA, קרן המחקר פרוג'ריה
טלפון: 978-535-2594
פקס: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
וונדי נוריס
טלפון: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org