தேர்ந்தெடு பக்கம்

அழியாத செல்

கலாச்சார நெறிமுறைகள்

 

அழியாத செல் கலாச்சார நெறிமுறை

பி.ஆர்.எஃப் செல் & திசு வங்கிக்கு அழியாத செல் கோடுகளை தாராளமாக உருவாக்கி வழங்கியதற்காக ஹார்வர்ட் பல்கலைக்கழகத்தின் டாக்டர் மார்ட்டின் டோர்ஃப் அவர்களுக்கு நன்றி கூறுகிறோம். நன்றி.

பி.ஆர்.எஃப் செல் கோடுகள் பின்வரும் நெறிமுறையைப் பயன்படுத்தி அழியாதவை:

ரெட்ரோவைரஸ் தொற்று

A. வைரஸை உருவாக்குதல்: இடமாற்றத்திற்கு 12-24 மணிநேரம், பேக்கேஜிங் HEK293 கலங்கள் 100 மிமீ தட்டில் 60-80% சங்கமத்தில் பூசப்பட்டன. ஒவ்வொரு தட்டுக்கும் 12μg ரெட்ரோவைரல் கட்டமைப்பான pBABE-puro (SV40T) மற்றும் 12μg pCL-Ampho Retrovirus Packaging Vector உடன் இணைக்கப்பட்டது. இடமாற்றத்திற்குப் பிறகு கலாச்சார ஊடகம் 8-10 மணிநேரம் ஆசைப்பட்டது, அதற்கு பதிலாக 10 மில்லி முழுமையான ஊடகம் மாற்றப்பட்டது. உகந்த வைரஸ் டைட்டரை அடைய கூடுதல் 48-72 மணிநேரத்திற்கு இந்த கலாச்சாரம் அடைகாக்கப்பட்டது.

பி. இலக்கு கலங்களை பாதித்தல்: இலக்கு செல்கள் நோய்த்தொற்றுக்கு முன் 100 மிமீ தட்டில் 12-18 மணிநேரத்தில் பூசப்பட்டன. பேக்கேஜிங் கலங்களிலிருந்து நடுத்தரமானது 0.45-cellm செல்லுலோஸ் அசிடேட் அல்லது பாலிசல்போனிக் வடிகட்டி மூலம் சேகரிக்கப்பட்டு வடிகட்டப்பட்டது. செல்கள் 40-60% சங்கமித்தவுடன், 8 மில்லி வைரஸ் கொண்ட ஊடகம் 10 μg / ml பாலிபிரீனின் இறுதி செறிவுடன் சேர்க்கப்பட்டது. H 12 மணிநேர இடைவெளியில் மூன்று சுற்று நோய்த்தொற்றுகள் தொடர்ச்சியாக மேற்கொள்ளப்பட்டன. 24 மணிநேர அடைகாக்கும் பிறகு ஊடகம் மாற்றப்பட்டது.

C. நிலையான செல் கோடுகளின் தேர்வு: நோய்த்தொற்றுக்குப் பிறகு 72 மணிநேரம், செல்கள் ட்ரிப்சினைஸ் செய்யப்பட்டு, 1: 3 இல் பிரிக்கப்பட்டு 100 μg / ml புரோமைசின் முன்னிலையில் இரண்டு 3 மிமீ தகடுகளுக்கு மாற்றப்பட்டன, மேலும் ஆண்டிபயாடிக் இல்லாமல் ஒரு கட்டுப்பாட்டு தட்டு. நிலையான செல் கோடுகளை உருவாக்க சுமார் 2 முதல் 3 வாரங்களுக்கு ஒவ்வொரு 2 அல்லது 4 நாட்களுக்கு கலாச்சார ஊடகம் மாற்றப்பட்டது.

 

வளர்ச்சி ஊடகம்

DMEM- இன்விட்ரஜன் # 11960-044 (எல்-குளுட்டமைன் இல்லாத உயர் குளுக்கோஸ்)

15% FBS கரு போவின் சீரம்

1% (1x) பென்சிலின்-ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் (இன்விட்ரஜன் # 15140-122)

1% (1X) எல்-குளுட்டமைன் (இன்விட்ரஜன் # 25030-081)

0.75 μg / ml puromycin (InvivoGen # ant-pr-1)

டிரைபிசின்

டிரிப்சின் EDTA C .25% (இன்விட்ரஜன் # 25200-056)

ஹாங்கின் சமச்சீர் உப்பு தீர்வு

HBSS- (இன்விட்ரஜன் # 14170 (1 எக்ஸ்) (-) கால்சியம் குளோரைடு, (-) மெக்னீசியம் குளோரைடு, (-) மெக்னீசியம் சல்பேட்)

உறைபனிக்கு டி.எம்.எஸ்.ஓ.

செல் கலாச்சார தரம் டி.எம்.எஸ்.ஓ.

செல்கள் சுமார் 5 x 10 செறிவில் உலர்ந்த பனியில் உறைந்திருக்கும்5மின்கலங்கள் / குப்பியை

ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்களைக் கரைப்பதற்கான நெறிமுறை

  1. 37 water C நீர் குளியல் கலங்களை வேகமாக கரைக்கவும்.
  2. குப்பியின் வெளிப்புறத்தை 70% எத்தனால் கொண்டு துடைக்கவும்.
  3. பியூரோமைசின் இல்லாமல் கரைந்த செல்களை எக்ஸ்என்யூஎம்எக்ஸ் மில்லி வளர்ச்சி ஊடகங்களைக் கொண்ட டிஎக்ஸ்என்எம்எக்ஸ் பிளாஸ்க்கு மாற்றவும்.
  4. ஒரே இரவில் 37 ° C இன்குபேட்டரில் குடுவை வைக்கவும்.
  5. அடுத்த நாள், செல்கள் இணைக்கப்பட்டுள்ளதா என்பதை உறுதிப்படுத்த நுண்ணோக்கின் கீழ் கவனிக்கவும்.
  6. மீடியாவை அகற்றி புதிய வளர்ச்சி ஊடகத்துடன் மாற்றவும்.

பி.ஆர்.எஃப் செல் கோடுகளை துணைப்பண்படுத்துதல்

1) செல்கள் நிறுவப்பட்டு வளரும்போது, ​​0.75 μg / ml புரோமைசின் கொண்ட ஊடகங்களைப் பயன்படுத்தத் தொடங்குங்கள். 0.75 μg / ml puromycin கொண்ட ஊடகங்களில் உள்ள கலங்களை தொடர்ந்து பராமரிக்கவும்.

2) சங்கமமாகும்போது கலங்கள் பிரிக்கப்பட வேண்டும்.

3) செல்களைப் பிரிக்க (கொடுக்கப்பட்ட தொகுதிகள் செல்கள் ஒரு T25 இல் இருப்பதாக கருதுகின்றன):

A. மலட்டு நுட்பத்தைப் பயன்படுத்தி, மீடியாவை அகற்றி, 2-3 மில்லி மலட்டு HBSS உடன் குடுவை துவைக்கவும். HBSS ஐ அகற்றி நிராகரிக்கவும்.

B. 1 மில்லி ட்ரிப்சின் சேர்த்து 2-3 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கும். செல்கள் தலைகீழ் நுண்ணோக்கின் கீழ் சரிபார்க்கப்பட வேண்டும், அவை வட்டமிடுவதற்கும், தூக்குவதற்கும், மிதப்பதற்கும் தொடங்கியுள்ளனவா என்பதை தீர்மானிக்க. 3 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு செல்கள் பிரிக்கப்படாவிட்டால், நீங்கள் மற்றொரு 1-2 நிமிடங்களை அடைகாக்கலாம்

சி. அனைத்து கலங்களையும் வெளியேற்றுவதற்காக தொப்பியை இறுக்கி, மெதுவாக நுனி பிளாஸ்கை பக்கத்திலிருந்து பக்கமாக மாற்றவும். தேவைப்பட்டால் செல்களை தளர்த்துவதற்கு பக்கவாட்டில் லேசாக தட்டலாம்.

டிரிப்சின் செயலிழக்க செல்கள் மிதந்தவுடன் புதிய ஊடகத்தின் 4 மில்லி பிளாஸ்கில் சேர்க்கவும். புதிய செல்கள் மூலம் பிளாஸ்கின் பக்கங்களை பல முறை கழுவவும், எல்லா கலங்களையும் பிளாஸ்டிக்கிலிருந்து கழுவவும் தீர்வுக்கு கொண்டு செல்லவும். கலங்களைக் கொண்ட அனைத்து திரவங்களையும் அகற்றி, ஒரு 15ml கூம்புக்கு மாற்றவும் (அல்லது நீங்கள் 50 அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட ஃபிளாஸ்களை பூல் செய்கிறீர்கள் என்றால் 3 மில்லி).

E. மலட்டு நுட்பத்தைப் பயன்படுத்தி, ஒரு ஹெமசைட்டோமீட்டரில் எண்ணுவதற்கு ஒரு அலிகோட்டை அகற்றவும்.

F. நீங்கள் கலங்களை எண்ணும்போது, ​​மீதமுள்ள தீர்வு மருத்துவ மையவிலக்குகளில் 5 நிமிடங்களுக்கு 1000 rpms இல் சுழற்றப்பட வேண்டும்.

4) உங்கள் செல் எண்ணிக்கையை கணக்கிட்ட பிறகு, தட்டு செல்கள் 2.5 x 10 ஆக இருக்கும்5 T 25 வடிப்பான் மேல் குடுவைக்கு செல்கள்.

5) ஒவ்வொரு 2-3 நாட்களிலும் 0.75 μg / ml puromycin கொண்ட புதிய வளர்ச்சி ஊடகத்துடன் கலங்களுக்கு உணவளிக்க வேண்டும்.

உறைபனி:

கலங்கள் 5x 10 க்கு குறையாமல் உறைந்திருக்க வேண்டும்5 செல்கள் / மில்லி / கிரையோவல் வளர்ச்சி ஊடகங்களில் 10% DMSO மற்றும் 30% FBS ஆகியவற்றைக் கொண்டுள்ளது புரோமைசின் இல்லாமல் பின்னர் ஒரே இரவில் -80 at C இல் ஒரு ஐசோபிரபனோல் உறைபனி அறையில் வைக்கப்படுகிறது. அடுத்த நாள் திரவ நைட்ரஜனுக்கு மாற்றவும்.

மேலும் தகவலுக்கு தொடர்பு கொள்ளவும்:

லெஸ்லி பி. கார்டன், எம்.டி., பி.எச்.டி.

பிரவுன் பல்கலைக்கழகத்தின் குழந்தை மருத்துவ ஆராய்ச்சி பேராசிரியர் வாரன் ஆல்பர்ட் மருத்துவப் பள்ளி மற்றும் குழந்தை மருத்துவவியல் துறை, ஹாஸ்ப்ரோ குழந்தைகள் மருத்துவமனை, பிராவிடன்ஸ், ஆர்ஐ மயக்க மருந்துத் துறை, குழந்தைகள் மருத்துவமனை பாஸ்டன் மற்றும் ஹார்வர்ட் மருத்துவப் பள்ளி, போஸ்டன், எம்.ஏ. மருத்துவ இயக்குநர், புரோஜீரியா ஆராய்ச்சி அறக்கட்டளை

தொலைபேசி: 978-535-2594
தொலைநகல்: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

வெண்டி நோரிஸ்
பி.ஆர்.எஃப் செல் மற்றும் திசு வங்கி
தொலைபேசி: 401-274-1122 x 48063
wnorris@lifespan.org

பதிவு செய்

எங்கள்

செய்திமடல்!

இப்பொது பதிவு செய்

ஒன்றாக, நாங்கள்

விருப்பம்

சிகிச்சை கண்டுபிடி!

இப்போது தானம்