Protocollo per la coltura dei linfoblasti

Terreno di coltura

Modello RPMI 1640 – ThermoFisher # 11875
15% Siero bovino fetale (FBS) – ThermoFisher #10437-028
1% (1X) Penicillina-Streptomicina (facoltativo) – ThermoFisher #15140-122

Note generali

• Il terreno di coltura deve essere sempre equilibrato nell'incubatrice a 37°C, 5% CO₂ per 30 minuti prima dell'uso
• Utilizzare sempre fiaschette con tappi ventilati
• Incubare sempre il pallone in posizione verticale
• Non utilizzare più di 20 ml in una beuta T25

Scongelamento delle cellule congelate

Le cellule congelate saranno ricevute in aliquote da 1 ml su ghiaccio secco. Mantenere le cellule congelate fino allo scongelamento per la coltura cellulare o conservarle in azoto liquido se non si avviano subito le colture. Tuttavia, si raccomanda che se si intende conservare le cellule per un uso successivo, si creino scorte fresche e si congelano più fiale. Le cellule sono crioconservate in 45% RPMI-1640, 50% FBS e 5% DMSO (grado di coltura tissutale).

1. 1. Versare 10 ml di RPMI-1640, siero fetale bovino (FBS) 15%, ± antibiotici in una fiaschetta T-25 con tappo ventilato.
   2. Lasciare che il terreno si stabilizzi in un incubatore umidificato a 37°C con CO 5%₂ all'aria per 30 minuti. Le beute devono essere incubate in posizione verticale.
   3. Scongelare ciascuna fiala o flacone di cellule congelate in un bagno d'acqua a 37°C o in un becher di acqua tiepida, una alla volta.
   4. Pulisci rapidamente l'esterno dell'ampolla o della fiala con etanolo 70%. Se le cellule sono in un'ampolla di vetro, romperla con attenzione, assicurandoti di proteggere le dita dal vetro rotto.
   5. Rimuovere 1 ml di cellule congelate con una pipetta sterile e metterle in una beuta T-25 con 10 ml di terreno. Etichettare chiaramente la beuta per identificare ogni linea cellulare.
   6. Posizionare il pallone in un incubatore umidificato a 37°C con 5% CO₂ nell'aria. Le beute devono essere incubate in posizione verticale.
   7. Dopo 24 ore, rimuovere 5 ml di terreno dalla parte superiore del pallone, senza toccare i linfociti depositati sul fondo, e sostituirli con 5 ml di terreno preriscaldato.
   8. Procedere con il protocollo di coltura delle cellule linfoblastiche.

Coltura linfoblastica

1. 1. Tre o quattro giorni dopo lo scongelamento, conta le cellule. Le cellule non sono aderenti e crescono in grumi. Rompere i grumi pipettando delicatamente.
   2. Contare le cellule.
   3. Idealmente, la concentrazione cellulare non dovrebbe superare 2 x 10⁶ cellule/ml.
   4. A seconda della concentrazione cellulare, reinserire, dividere o congelare le cellule.
   5. Rialimentare aggiungendo 5-6 ml di terreno di coltura equilibrato.
   6. Seminare nuove colture a non meno di 2 x 10⁵ cellule/ml.
   7. Le cellule devono essere congelate a circa 5 x 10⁶ cellule/ml. Seguire il protocollo di congelamento cellulare.

Congelamento dei linfoblasti

1. 1. Le cellule devono essere congelate a circa 5 x 10⁶ cellule/ml.
   2. Trasferire il volume appropriato di cellule in una provetta conica da 15 o 50 ml.
   3. Centrifugare a 4°C a 100 xg per 10 minuti.
   4. Rimuovere il terreno e risospenderlo in un volume appropriato di terreno di congelamento freddo.
   5. Trasferire 1 ml di cellule ciascuna nella crioprovetta.
   6. Collocare le crioprovette nella camera di congelamento e riporre la camera nel congelatore a -80°C per tutta la notte.
   7. Il giorno successivo, trasferire le crioprovette nell'azoto liquido.

Wendy Norris