הפשרת תאי PRF

1. להפשיר תאים במהירות באמבט מים 37˚C.
2. נגב את החלק החיצוני של הבקבוקון בעזרת אתנול 70%.
3. העבירו את התאים שהופשרו לבקבוק T25 המכיל 5 מ"ל של אמצעי הגידול.
4. הניחו את הבקבוק בחממה של 37˚C למשך הלילה.
5. למחרת, התבונן תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים נקשרו.
6. הסר חומרי הדפסה והחלף בחומרי צמיחה טריים.

שורות תאי PRF תת-תרבותיות

1. יש לפצל תאים כאשר הם מאוחדים.
2. לפיצול תאים (הנפחים שניתנו בהנחה שהתאים נמצאים ב- T25):
   א) באמצעות טכניקה סטרילית, הסר מדיה ושטוף את הבקבוק עם 2-3 מיליליטר של HBSS סטרילי. הסר וזורק את HBSS.
   ב) הוסף טריפסין מ"ל 1 ודגור במשך 2-3 דקות. יש לבדוק תאים במיקרוסקופ הפוך כדי לקבוע אם הם החלו להתעגל, להרים ולצוף. אם התאים לא מנותקים לאחר 3 דקות, אתה יכול לדגור 1-2 דקות נוספות.
   ג) הדק את הכובע והטה את הבקבוק בעדינות מצד לצד כדי לעקור את כל התאים. ניתן להקיש בקבוק בקלילות בצד כדי לשחרר תאים במידת הצורך.
   ד) הוסף 4 מ"ל של מדיה חדשה לבקבוק ברגע שהתאים צפים כדי להשבית את הטריפסין. שטפו את צידי הבקבוק מספר פעמים עם המדיה החדשה כדי לשטוף את כל התאים מהפלסטיק ולתמיסה. הסר את כל התאים המכילים נוזלים והעביר אותו לחרוטי 15 מ"ל (או 50 מ"ל אם אתה מאגד 3 צלוחיות או יותר).
   ה) באמצעות טכניקה סטרילית, הסר aliquot לספירה על hemocytometer.
   ו) בזמן שאתה סופר תאים, יש לסובב את שאר התמיסה בצנטריפוגה הקלינית למשך 5 דקות ב -1000 סל"ד.
3. לאחר חישוב ספירת התאים שלך, צלחת תאים בגודל 2.5 x 10⁵ תאים לכל בקבוק העליון של המסנן T25.
4. יש להאכיל תאים בכל 2-3 יום עם מדיום גידול טרי.

קְפִיאָה:

יש להקפיא תאים במהירות של לא פחות מ- 5 x 10⁵ תאים / מ"ל ​​/ cryovial בתקשורת גדילה המכילה 10% DMSO ו- 30% FBS והושם לאחר מכן בתא הקפאה איזופרופנול ב -80 ˚ לילה. מעבירים למחרת לחנקן הנוזלי.

פרוטוקול לתרביות משנה ולהקפאת פיברובלסטים